MiRNA-223 - регулятор пролиферации и активации нейтрофилов

Многими исследованиями показано: экспрессия miRNA-223 связана с миелоидными клетками в костном мозгу; она повышается при дифференцировке миелоидных предшественников в гранулоциты. Интересны наблюдения за мышами с нокаутом гена miRNA-223, которые оставались здоровыми и у них обнаруживалось повышенное число предшественников гранулоцитов в костном мозгу и зрелых

нейтрофилов в циркуляции. Считается, что miRNA-223 вовлечена в негативную регуляцию созревания, но не дифференцировки гранулоцитов. Действие miRNA-223, вероятно, опосредовано через отрицательное влияние другого миелоидного фактора (подобного ELF-1). Этот транскрипционный фактор участвует в пролиферации клеток миелоидного ряда. Функциональные исследования циркулирующих нейтрофилов нокаутных животных показали: miRNA-223 не вовлечена в выход клеток из сосудистого русла, миграцию или фагоцитоз ими Escherichia coli. Однако уменьшение количества miRNA- 223 приводит к усилению кислородного взрыва и цитотоксического ответа на действие грибов Candida albicans. У животных, нокаутных по miRNA-223, спонтанно развиваются воспалительные процессы в легких и наблюдается повышенное разрушение тканей после воздействия эндотоксинов. Обнаруживается быстрое и селективное увеличение экспрессии miRNA-223 в эпителии легких и бронхов после аэрозольного воздействия токсином. Большое количество факторов может регулировать экспрессию miRNA-223 в процессе дифференцировки и созревания гранулоцитов.

Таким образом, накапливается все больше фактов, свидетельствующих о том, что микроРНК представляет собой новый большой класс регуляторных молекул, участвующих во многих физиологических процессах организма. Важную роль микроРНК играют в развитии врожденного иммунного ответа. В основном эти молекулы блокируют или активируют адаптерные молекулы, которые необходимы для проведения сигнала с рецепторов врожденного иммунитета или для регуляции факторов транскрипции, участвующих в дифференцировке и созревании различных клеток врожденного иммунитета. Важно, что данные молекулы реализуют свое действие на посттранскрипционном уровне, благодаря чему изучение микроРНК представляет интерес, ибо, вероятно, оно будет способствовать более глубокому пониманию механизмов регуляции врожденного иммунитета. Следует отметить перспективность такого направления исследований, так как с каждым годом возрастает количество данных о возможностях miRNA регулировать врожденный иммунитет. Несомненно: miRNA вскоре станут основой для создания перспективных лекарственных средств, дающих эффект строго направленной коррекции нарушений врожденного иммунитета. Становится очевидной и необходимость разработки новых подходов к синтезу miRNA, изучению механизмов

их действия, поиску молекул-мишеней и новых методов тестирования, основанных в первую очередь на принципе ПЦР (см. табл. 6.1).

В настоящее время известно несколько методов для определения экспрессии генов микроРНК в биологических образцах.

Первым методом анализа является Northern blot. Он хорошо изучен и описан, однако довольно трудоемок, а кроме того, существует много ограничений использования образцов. Для определения зрелой микроРНК в пробе общую РНК наносят на 12% денатурирующий полиакриламидный гель. В качестве маркера используют низкомолекулярный олигонуклеотид. После электрофореза пробы помещают на мембрану и проводят гибридизацию с олигонуклеотидными пробами (меченными ³²Р изотопом или другой меткой), комплементарными зрелой форме изучаемой микроРНК. Далее мембраны отмывают от несвязавшихся олигонуклеотидных последовательностей и осуществляют детекцию с помощью радиочувствительной пленки (если метка ³²Р).

В последнее время для обнаружения молекул микроРНК в биологическом образце используют метод микрочипов (см. выше). Он позволяет исследовать образец на наличие одновременно большого количества молекул микроРНК. Недостаток такого подхода - необходимость содержания в образце больших количеств исследуемой РНК, что не всегда возможно.

Из клеточной культуры, в которой нужно определить микроРНК, выделяют общую РНК. Выделенный материал инкубируют с малыми последовательностями РНК, меченными флуоресцентными метками (Cy5, Cy3 и др). Далее меченый образец наносится на микрочип, содержащий ДНК-последовательности известных (по крайней мере 200) молекул микроРНК. После инкубации в течение 14 ч происходит гибридизация и затем планшет отмывается. Результат считывается при помощи флуоресцентного сканера (методически процесс описан выше). По свечению в лунках планшета определяют, какой из 200 образцов микроРНК экспрессируется в пробе.

Новый метод для определения уровня экспрессии генов микроРНК - количественная обратная транскрипция с ПЦР (ОТ-ПЦР) (см. выше). Этот метод имеет высокую специфичность и чувствительность.

Чтобы исследовать микроРНК с помощью ПЦР, необходимо модифицировать последнюю, ибо праймеры в обычной системе для ПЦР имеют тот же размер, что и исследуемая микроРНК. Разработан

новый методический подход, основанный на модификации ПЦР, названный miR-Q. Первым шагом в данной методике является встраивание последовательности искомой микроРНК в кДНК с известной последовательностью. Это осуществляется при реакции обратной транскрипции. После проводят ПЦР и детекцию полученного амплификата².

Вопросы и задания

1. Какие молекулярно-генетические методы используются для решения иммунологических задач?

2. Дайте определение термина «полимеразная цепная реакция» и опишите суть метода.

3. Какие существуют модификации ПЦР, применяемые в иммунологии? Почему они используются?

4. Нарисуйте схему последовательности этапов ПЦР.

5. Опишите трудности, возникающие при постановке ПЦР.

6. Перечислите преимущества ПЦР перед другими методическими подходами.

7. Что такое микрочипы?

8. Какие виды микрочипов вы знаете?

9. Какие иммунологические цели достижимы при использовании микрочипов?

10. Опишите метод получения мышей с нокаутом (knock-out) и нокином (knock-in) генов.

11. Как получить трансгенную мышь?

12. Что такое регуляторные микроРНК?

13. Каким образом регуляторные микроРНК могут быть применены в иммунологических исследованиях?

14. Назовите основные методы для определения микроРНК.

15. Что такое гибридомы?

16. Дайте определение моноклональных антител.

17. Опишите этапы получения гибридом.

18. Проиллюстрируйте принципы метаболической селекции клеток.

Глава 7

Методы оценки системы цитокинов

В настоящей главе будет рассмотрен комплексный подход в оценке системы цитокинов с использованием описанных ранее современных методов исследования.

Вначале мы изложим основные представления о системе цитокинов.

Цитокины в настоящее время рассматривают как белковопептидные молекулы, продуцируемые различными клетками организма и осуществляющие межклеточные и межсистемные взаимодействия. Цитокины - универсальные регуляторы жизненного цикла клеток, они контролируют процессы дифференцировки, пролиферации, функциональной активации и апоптоза последних.

Цитокины, продуцируемые клетками иммунной системы, называют иммуноцитокинами; они представляют собой класс растворимых пептидных медиаторов иммунной системы, необходимых для ее развития, функционирования и взаимодействия с другими системами организма (Ковальчук Л.В. и соавт., 1999).

Являясь регуляторными молекулами, цитокины играют важную роль в осуществлении реакций врожденного и адаптивного иммунитета, обеспечивают их взаимосвязь, контролируют гемопоэз, воспаление, заживление ран, образование новых кровеносных сосудов (ангиогенез) и многие другие жизненно важные процессы.

В настоящее время существует несколько различных классификаций цитокинов, учитывающих их строение, функциональную активность, происхождение, тип цитокиновых рецепторов. Традиционно, в соответствии с биологическими эффектами, принято выделять следующие группы цитокинов.

1. Интерлейкины (ИЛ-1-ИЛ-33) - секреторные регуляторные белки иммунной системы, обеспечивающие медиаторные взаимодействия в иммунной системе и связь ее с другими системами организма. Интерлейкины разделяют по функциональной активности на про- и противовоспалительные цитокины, ростовые факторы лимфоцитов, регуляторные цитокины и др.

3. Факторы некроза опухоли (ФНО) - цитокины с цитотоксическим и регуляторным действиями: ФНОа и лимфотоксины (ЛТ).

4. Факторы роста гемопоэтических клеток - фактор роста стволовых клеток (Kit - ligand), ИЛ-3, ИЛ-7, ИЛ-11, эритропоэтин, тробопоэтин, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор - ГМ-КСФ, гранулоцитарный КСФ - Г-КСФ, макрофагаль-

ный КСФ - М-КСФ).

5. Хемокины - С, СС, СХС (ИЛ-8), СХ3С - регуляторы хемотаксиса различных типов клеток.

6. Факторы роста нелимфоидных клеток - регуляторы роста, дифференцировки и функциональной активности клеток различной тканевой принадлежности (фактор роста фибробластов - ФРФ, фактор роста эндотелиальных клеток, эпидермальный фактор роста - ЭФР эпидермиса) и трансформирующие факторы роста (ТФРβ, ТФРα).

Среди прочих в последние годы активно изучается фактор, ингибирующий миграцию макрофагов (миграцию ингибирующий фактор - МИФ), который рассматривается как нейрогормон с цитокиновой и ферментной активностью (Суслов А.П., 2003; Ковальчук Л.В. и соавт.,

2004).

Цитокины различаются по строению, биологической активности и другим свойствам. Однако наряду с различиями цитокины обладают общими свойствами, характерными для данного класса биорегуляторных молекул.

1. Цитокины - это, как правило, гликозилированные полипептиды средней молекулярной массы (менее 30 кD).

2. Цитокины вырабатываются клетками иммунной системы и другими клетками (например, эндотелием, фибробластами и др.) в ответ на активирующий стимул (патогенассоциированные молекулярные структуры, антигены, цитокины и др.) и участвуют в реакциях врожденного и адаптивного иммунитета, регулируя их силу и продолжительность. Некоторые цитокины синтезируются конститутивно.

3. Секреция цитокинов - короткий по времени процесс. Цитокины не сохраняются как преформированные молекулы, а их

синтез начинается всегда с транскрипции генов. Клетки вырабатывают цитокины в низкой концентрации (пикограммы на миллилитр).

4. В большинстве случаев цитокины продуцируются и действуют на клетки-мишени, находящиеся в непосредственной близости (короткодистантное действие). Основное место действия цитокинов - межклеточный синапс.

5. Избыточность системы цитокинов проявляется в том, что каждый тип клеток способен продуцировать несколько цитокинов, а каждый цитокин может секретироваться различными клетками.

6. Для всех цитокинов характерна плейотропность, или полифункциональность действия. Так, проявление признаков воспаления обусловлено влиянием ИЛ-1, ФНОα, ИЛ-6, ИЛ-8. Дублирование функций обеспечивает надежность работы системы цитокинов.

7. Действие цитокинов на клетки-мишени опосредуется высокоспецифичными высокоаффинными мембранными рецепторами, представляющими собой трансмембранные гликопротеины, состоящие, как правило, более чем из одной субъединицы. Внеклеточная часть рецепторов ответственна за связывание цитокина. Существуют рецепторы, устраняющие избыток цитокинов в патологическом очаге. Это так называемые рецепторы-ловушки. Растворимые рецепторы представляют собой внеклеточный домен мембранного рецептора, отделенный с помощью фермента. Растворимые рецепторы способны нейтрализовывать цитокины, участвовать в транспорте их в очаг воспаления и в выведении из организма.

8. Цитокины работают по принципу сети. Они могут действовать согласованно. Многие функции, приписываемые первоначально одному цитокину, как оказалось, обусловлены согласованным действием нескольких цитокинов (синергизм действия). Примерами синергического взаимодействия цитокинов являются стимуляция воспалительных реакций (ИЛ-1, ИЛ-6 и ФНОа), а также синтеза IgE

(ИЛ-4, ИЛ-5 и ИЛ-13).

Одни цитокины индуцируют синтез других цитокинов (каскад). Каскадность действия цитокинов необходима для развития воспалительных и иммунных реакций. Способность одних цитокинов усиливать или ослаблять продукцию других обусловливает важные позитивные и негативные регуляторные механизмы.

Известно антагонистическое действие цитокинов, например продукция ИЛ-6 в ответ на увеличение концентрации ФНОа может быть

негативным регуляторным механизмом контроля выработки этого медиатора при воспалении.

Цитокиновая регуляция функций клеток-мишеней осуществляется с помощью аутокринного, паракринного или эндокринного механизмов. Некоторые цитокины (ИЛ-1, ИЛ-6, ФНОα и др.) способны участвовать в реализации всех перечисленных механизмов.

Ответ клетки на влияние цитокина зависит от нескольких факторов:

• от типа клеток и их исходной функциональной активности;

• от локальной концентрации цитокина;

• от присутствия других медиаторных молекул.

Таким образом, клетки-продуценты, цитокины и специфические для них рецепторы на клетках мишенях формируют единую медиаторную сеть. Именно набор регуляторных пептидов, а не индивидуальные цитокины, определяют окончательный ответ клетки. В настоящее время система цитокинов рассматривается как универсальная система регуляции на уровне целостного организма, обеспечивающая развитие защитных реакций (например, при инфекции).

В последние годы сложилось представление о системе цитокинов, объединяющей:

1) клетки-продуценты;

2) растворимые цитокины и их антагонисты;

3) клетки-мишени и их рецепторы (рис. 7.1).

Нарушения различных компонентов системы цитокинов приводят к развитию многочисленных патологических процессов, а потому выявление дефектов в этой регуляторной системе имеет важное значение для правильной постановки диагноза и назначения адекватной терапии.

Вначале рассмотрим основные компоненты системы цитокинов.