Цианметгемоглобин әдісі.

Гематологияда, референт ретінде қ алыптандыру Халық аралық комитетінің ұ сынғ ан ә дісі. Цианметгемоглобиндік ә діс дә лме-дә лдігімен, қ арапайымдылығ ымен, арзан жә не гематологиялық жіктегіштердің қ олдану ың ғ айлылығ ымен сипатталады. Оның жоғ ары дә лме-дә лдігі гемоглобиннің барлық тү рлері тасымалдаушы ерітіндінің қ атысуымен цианметгемоглобинге ауысып, сонымен бірге ерітіндінің оптикалық қ ысымы Бугер-Ламберт-Бер заң ына бағ ынады.

Гемиглобинцианид сақ тауғ а ө те тұ рақ ты жә не қ олайлы. Оның миллимолекулярлық экстинциясы белгілі (11, 0 л/моль х см).

Шарты: қ анғ а реагент қ осылғ анда гемоглобин цианметгемоглобинге айналады. Цианметгемоглобиннің мө лшері фотометрия арқ ылы тіркеледі.

Теміркө к калий ә серінен гемоглобин метагемоглобинге дейін қ ышқ ылданады, кейіннен калий цианин кө мегімен цианметгемоглобинге айналады..

Керекті жабдық тар мен реактивтер:

- Фотоколориметр;

- Драбкин (тасымалдаушы) ерітіндісі (NaHCO -1 г, KCN - 0.05 г, K[Fe(CN)] – 0.2 г;

- 1 литр залалсыздандырғ ан су.

Анық тау жү рісі. Пробиркағ а 5 мл тасымалдаушы ерітінді қ ұ йылады, оғ ан 20 мкл қ ан қ осылады (қ атынасы 1: 251). Қ оспаны араластырғ ан соң 10 минуттан кейін (осы уақ ытта гемоглобин гемоглобинцианидке айналады) экстинкция тіркеледі: толқ ынның ұ зындығ ы 540 нм, қ абаттың қ алың дығ ы 1см, суғ а қ арама қ арсы. Жұ мыс кезінде 1, 5 мл, 3 мл жә не 4, 5 мл пластик кюветтерді қ олдануғ а болады.

Фотометрде 540 нм немесе ФЭК – 520-560 нм толқ ын ұ зындығ ында (жасыл сә уле фильтрі), жол ұ зындығ ы 10мм кюветте, тасымалдаушы ерітіндіге (бақ ылау) қ арама қ арсы анық тау жұ мысы жү ргізіледі.

Гемиглобинцианид жағ дайы белгілі кө лемде жә не 367, 7 (g = 570 нм) тең. Оны мына формуламен шығ аруғ а болады:

А [540НіСN] х 16114, 5 х 10 х Р

Hb (г/л) = -------------------------------------------- = 367.7 x А [540НіСN]; сонда

11, 0 х L

А [540НіСN] – 540 нм толқ ын ұ зындығ ында гемоглобин ерітіндісінің сорылуы;

16114, 5 гемоглобин мономердің молекулярлық массасы;

L – оптикалық жолдың ұ зындығ ы, кө птеген фотометрлерде 10мм тең;

10 – гемоглобиннің молекулярлық массасын миллимолекулярлы массағ а ауыстыру;

Р – қ анның сұ йылуы (1: 251, қ ан 20 мкл жә не 5, 0 мл тасымалдаушы ерітіндінің қ атынасы).

Қ азіргі кезде цианиометгемоглобин қ алыпты тү рде шығ арылады, ол гемоглобиннің концентрациясын дә лме-дә л анық тауғ а қ олданылады. Нә тижені калибр қ исық ты сызумен анық талады. Миллиметрлік қ ағ азғ а ұ зынынан абцисс сызығ ының паспортында кө рсетілген гемоглобиннің концентрациясы г/л (ампуладағ ы гемиглобинцианид мө лшеріне сә йкес) сызылады. Кө лденең – ординатта – гемиглобинцианид ерітіндісінің абсорбциялық мө лшері немесе гемоглобинометрдің кө рсеткіші жасалады. Калибрлі график координаттың басынан сызылғ ан тік сызық болуы керек. Егерде сызык тік болмаса, онда қ ателік жіберілгенінің немесе жабдық бұ зылғ анының кө рсеткіші. Ә р фотометрдің ө зіне тә н сызығ ы жасалады. Калибрлі сызық бойынша формула шығ арылады

Патологиялық жағ дайлар кезіндегі гемоглобиннің ө згерістері.

Гемоглобинопатиялар (гемоглобиноздар) гемоглобиннің нә руызды бө ліктердің тұ қ ым қ уалайтын бұ зылыстарына байланысты.

Орақ тә різді жасушалық қ ан аздық – гемоглобинопатияның тү рі. Молекулярлы дең гейде, гемоглобин шынжырларының жинақ талуын бақ ылайтын гендер қ ұ рылысының мутациясынан глутамин аминқ ышқ ылдары валин аминқ ышқ ылдарына ауысады. Бұ л патологияда қ анның ерекше қ асиеті - эритроциттер қ оршағ ан ортасында оттегінің тиісті қ ысымдылығ ының тө мендігінен орақ тә різді болады.

Орақ тә різді эритроциттерді анық тауғ а арнайы сынама қ олданады – ол ү шін вена қ анын гипоксияғ а ұ щыратады.

Анық тау жү рісі. 5 минутқ а қ олдың саусағ ын байлап, қ ан алынады қ анғ а метабиосульфат жү рісі натрий қ осылады, сонда орақ тә різді эритроциттер пайда болады.

Тү сті кө рсеткіш.

Тү сті кө рсеткіш (ТК) эритроциттегі гемоглобиннің салыстырмалы мө лшерін кө рсетеді, клиникалық МСН сә йкес жә не МСV тү зуге қ атысады. Тү стік кө рсеткіштің мө лшеріне қ арай гипо- (ТК < 0, 8), қ алыпты -(ТК = 0, 85-1, 05) жә не гиперхромды (ТК > 1, 1) деп бө леді.

ТК формуламен есептелінеді:

Hb сынау RBC сынау

ТК = ---------------------: ----------------------, сондағ ы

Hb қ алыпты RBC қ алыпты

Hb бақ ылау - зерттелген қ андағ ы гемоглобиннің мө лшері

Hb қ алыпты – гемоглобиннің қ алыпты кө рсеткіші (1л қ анның Hb қ алыпты кө рсеткіші ескеріледі).

RBC бақ ылау – зерттелген қ андағ ы эритроциттердің саны

RBC қ алыпты - эритроциттердің қ алыпты кө рсеткіші (1л қ анның Э қ алыпты саны ескеріледі).

Барлығ ын қ ысқ артқ аннан кейін

3 х Hb

ТК = -------------------------------------------

RBC cынау (бірінші ү ш саны)

ТК қ алыпты кө рсеткіші 0, 86 – 1, 05 тең.

Сенімді жә не дә лме-дә л ә дістерге эритроциттердің орташа аумағ ының анық талуы (MCV) – гематокриттің кө лемі 1мм қ андағ ы эритроциттердің санына бө лінеді. Нә тижесі ку/микронда (мкм) немесе фемтолитрда (фл) белгіленеді.

Гематокрит () х 10

MCV = ---------------------------------------------------------;

Эритроциттердің саны (млн.кл/мм)

МCV нақ ты кө рсеткіші, себебі эритроциттердің диаметрін анық тағ анда эритроциттердің морфологиясында ө згерістер болады:

· жағ ынды кеуіп қ алғ анда эритроциттердің диаметрі 10-20% -ғ а кішірейеді

· қ алың жағ ындыда эритроциттердің диаметрі кіші

· жағ ындыда ұ зыннан жатқ ан эритроциттердің диаметрі ү лкендеу.

Қ алыпты кө рсеткіші – 80-95 фл (мкм). Адамның ө мірінде MCV кө рсеткіші бірнеше рет ө згерістерге ұ шырайды: нә рестелерде 128фл-ге дейін жетеді, ө мірінің бірінші аптасында 100-112фл дейін тө мендейді, алты айлығ ында 78фл тү седі, бір жаста 77-78фл тең, 4-5 жаста тө менгі кө рсеткіші (80фл) тұ рақ талады. MCV 80фл дейін тө мендесе – микроцитоздың, 95фл кө терілсе – макроцитоздың белгісі.

Эритроциттегі гемоглобиннің мө лшері (MCН) формуламен есептеледі

Гемоглобин (г/л)

МСН = -----------------------------------------

Эритроциттердің саны (млн/л)

Нә тижесі пикограммен (пг) белгіленеді, қ алыпты кө рсеткіші 27-31пг. Бұ л кө рсеткіш ә р эритроциттің ішіндегі гемоглобиннің орташа мө лшерін кө рсетеді. Ол ТК ұ қ сас. Осы индекстер бойынша қ ан аздығ ы қ алыпты-, гипо-, гиперхромды тү рлеріне бө лінеді.

Эритроциттің ішіндегі гемоглобиннің орташа мө лшері (МСНС) – гемоглобиннің мө лшері г/100 бө лінеді гематокрит кө рсеткішіне жә не 100 кө бейтіледі.

Гемоглобин (г/дл)

МСНС = ----------------------------- х 100 (г/дл)

Гематокрит (%)

Екі индекстің айырмашылығ ы: МСН бір эритроциттің ішіндегі гемоглобиннің кө лемін кө рсетеді жә не пикограммен белгіленеді. МСНС эритроциттің ішіндегі гемоглобиннің концентрациясының кө рсеткіші, ол гемоглобиннің қ арқ ындылығ ын кө рсетеді, қ алыпты жағ дайда 30-38г/дл тең. МСНС, МСН салыстырғ анда, ө те сезімтал сынама гемоглобиннің тү зілуінің бұ зылғ анын кө рсетеді. Гемоглобиннің шекті концентрациясы (38 г/дл) сирек кездесетін жағ дай. Оның жоғ арылауы гемоглобиннің кристалдарғ а айналуымен жә не эритроциттердің гемолизге ұ шырауымен аяқ талады.

Эритроциттердің осмостық тұ рақ тылығ ын анық тау

Осмостық тұ рақ тылық – эритроциттер гипотониялық тұ здардың ерітінділеріне тұ рақ тылығ ы. Осмостық қ ысымдылығ ы, қ анның осмостық қ ысымдылығ ына тең ерітінділерде эритроциттер ө згермейді. Тұ зды ерітінділердің осмостық қ ысымдылығ ы мен қ анның осмостық қ ысымдылығ ына тең болса, ондай ерітінділер изотониялық деп аталады. Изотониялық ерітінділерге 0, 85-0, 9%-дық натрий хлоридінің ерітіндісі жатады. Эритроциттер 0, 85% концентрациядан тө мен – гипотониялық ерітіндіге салынса олар ісініп, жарылады (гемолиз). Гипертониялық ерітінділерде эритроциттер жиырылады, себебі ішіндегі сулар ү лкен осмостық қ ысымдылық пен ерітіндіге шығ ады. Эритроциттердің осы қ асиетіне осмостық тұ рақ тылық тың анық талуы негізделген.

Эритроциттердің физикалық жә не химиялық қ асиеттерін бағ алау ү шін Л.И.Идельсон (1974) модификациясы қ олданылады.

Шарты. Эритроциттердің санды гемолиз дә режесін буферлі натрий хлоридін гипотониялық ерітінділерде анық тау.

Реактивтер. Негізгі ерітінді (осмостық концентрациясы 10% натрий хлорид ерітіндісіне сә йкес), рН ортасы 7, 4. Қ ұ рамы: екі орнын басқ ан натрий фосфаты (Nа2НРО4) – 27, 31 г (немесе Na2НРО4 х Н2О – 34, 23г), бір орнын басқ ан натрий фосфаты (NаН2РО4 х Н2О) – 4, 86, натрий хлориді – 180г, залалсыздандырылғ ан су – 2 литрге дейін. Ерітіндіні жабық ыдыста, мұ здатқ ышта бірнеше айғ а дейін сақ тауғ а болады.

1% натрий хлорид жұ мыс ерітіндісін дайындауғ а, негізгі ерітінді 10 есе сү йылтылады. 1% натрий хлорид ерітіндісінен келесі концентрациялар дайындалады: 0, 85; 0, 75; 0, 70; 0, 65; 0, 60; 0, 55; 0, 50; 0, 45; 0, 40; 0, 35; 0, 30; 0, 20; 0, 10. Бұ л ерітінділерді 100 мл дайындап, мұ здатқ ышта 2 аптағ а дейін сақ тауғ а болады.

Анық тау жү рісі. Екі залалсыздандырылғ ан пробиркағ а 2 тамшыдан гепарин жә не 1, 5мл қ ан қ ұ йылады. Араластырып, бір пробирканы зерттеуге жұ мсалады, екіншісі – термостатқ а бір тә улікке қ ойылады. Штативке қ ойылғ ан жә не концентрациялары жазылғ ан, 14 центрифугалық пробиркалар қ ойылады. Ә р пробиркағ а 5, 0 мл 1 - 10% натрий хлорид ертіндісі қ ұ йылады жә не оларғ а 0, 02 мл Сали пипеткасымен гепаринді қ ан қ осылады. Араластырып, 30 минутқ а бө лме температурасында қ алдырылады. Пробиркадағ ы қ оспалар, центрифугада 2000 айналым/мин 5 минут айналдырылғ ан соң, ү стің гі сұ йық ты тө гіп, фотоколориметрде толқ ынның ұ зындығ ы 500-560 нм (жасыл сә улефильтр), кюветтің қ алың дығ ы 10мм, бақ алауғ а қ арама-қ арсы қ ойылып анық талады. Бақ ылау сынамасы – 1% натрий хлорид ерітіндісі.

Есептеу. 100% гемолиз – егерде пробиркадағ ы 0, 1% буфер ерітіндісінде гемолиз болса. Ә р пробиркадағ ы гемолиздің жеке пайызы есептеледі, ү стің гі сұ йық тың экстинциясы 100% алынғ ан экстинсиямен салыстырып, формуламен шығ арылады:

Ех Х 100

% Гемолизі = ---------------------------------, сонда

Е1

Е1 – пробиркадағ ы 0, 1 натрий хлорид ерітіндінің ү стің гі сұ йық тың экстинциясы

Ех – зерттелетін сынамының экстинциясы

100 – 0, 1 натрий хлорид ертіндісімен пробиркадағ ы гемолиздің пайызы.

Келесі кү ні, 24 сағ атқ а қ алдырылғ ан қ анның зерттеуін қ айталау керек, себебі кейбір кезде эритроциттердің осмостық тұ рақ тылық тың тө мендеуі термостатта тұ рғ ан қ анда анық талады.

Қ алыпты кө рсеткіші. Сау адамда жаң адан алынғ ан қ анда гемолиз 0, 50-0, 45% натрий хлорид ертіндісінде байқ алады, толық гемолиз – 0, 40-0, 35% NaCI концентрациясында тіркеледі.

Клиникалық маң ыздылығ ы. Зерттеу гемолиздік қ ан аздығ ына кү діктенген кезінде ө ткізіледі. Осмостық тұ рақ тылық тың тө мендеуі, яғ ни эритроциттердің натрий хлорид ерітіндісінің 0, 70-0, 75% концентрациясында гемолиз пайда болса, ол тұ қ ым қ уалайтын микросфероциттік жә не кейбір тұ қ ым қ уалайтын сфероциттік емес гемолитикалық қ ан аздық тарында, сонымен бірге кейбір кезде аутоиммундық гемолиздік қ ан аздық тарында байқ алады. Осмостық тұ рақ тылық тың жоғ арлауы талассемияғ а, гемоглобинпатияғ а тә н

Гематокритті анық тау.

Алдын ала антикоагулянтпен ө ң делген жә не кептірілген капилляр 7/8 ұ зындығ ы зерттелетін қ анмен толтырылады. Капиллярдың бір ұ шы арнайы сағ ызбен жабылады. Сонан соң центрифуганың роторына салынады. Салынғ ан кезде капиллярдың жабылғ ан ұ шы резинкалық табанғ а тіреліп тұ руы керек. Центрифугада 11000 д (8000 айналым/мин.) 5 минут айналады. Гематокрит кө лемі қ ызыл қ анның мө лшері бойынша тіркеледі.

Гематокрит мө лшерін анық тауғ а коммерциялық гепаринді жә не гепаринсіз гематокрит стандартты 75мм, 70мм жә не 30мм капилярлары (Deltalab) қ олданылады.

Антикоагулянттар: гепарин 5000ЕД/мл дистилденген сумен 1: 5 сұ йылтады немесе К2-ЭДТА (трилон Б) – 40 г/л.

Ретикулоциттерді анық тау.

Ретикулоциттерді бриллианттық крезил кө кпен, азур І немесе азур ІІ боялғ аннан соң есептеу ә дісі.

Шарты. Ретикулоциттердің дә некті-жіпшік субстанциясын анық тауғ а суправитальді бояғ ыштармен бояу.

Келесі бояғ ыштарды қ олдануғ а болады:

1. Абсолюттік спиртте ерітілген қ анық бриллианттық крезил кө к ерітіндісін

(абсолюттік спиртті дайындау: 96% этанолғ а бірнеше рет ауыстырып қ ыздырғ ан мыс купоросында ұ стау керек). 100 мл абсолюттік спиртке+1, 2г бояу.

2. Азур І ерітіндісі. Азур І – 1г, аммоний оксалаты – 0, 4г, натрий хлориді – 0, 6-8г, 96 этил спирті – 10 мл, залалсыздандырылғ ан су – 90 мл. Ерітінді тығ ынмен жабылғ ан ыдысқ а қ ұ йылып, 2-3 кү н 37⁰С термостатта ұ сталып, арасында шайқ ап тұ ру қ ажет, сонан соң бө лме температурасына дейін суытып, қ ағ аз фильтрден ө ткізіледі. Дайын ерітінді кү ң гү рт ыдыста сақ талады. Бояудың тұ нбасы пайда болса, қ айтадан сү зіп алынады.

3. Азур ІІ ерітіндісі. Азур ІІ – 1г, натрий цитраты – 5г, натрий хлориді – 0, 4г, залалсыздандырылғ ан су – 45 мл. Ерітінді термостатта 37⁰С екі тә улікке қ алдырылады, арасында шайқ алып тұ ру қ ажет. Бояу тез еру ү шін, ә лсіз отқ а 15-20 минут, қ айнатпай, қ ыздырып алуғ а болады. Бө лме температурасына дейін суытып, сү зіледі. Кү ң гірт ыдыста сақ талады.

Ә йнекте бояу. Таза, майсыздандырылғ ан жағ ынды ә йнекті спирт отына жылытып, ү стіне ә йнекті таяқ шамен бір тамшы бояу тамызылады жә не қ ырнақ талғ ан ә йнекпен бояуды жағ ады. Бояу жағ ылғ ан жағ ынды ә йнектің ү сті белгіленеді. Осы ә діспен кө п бояудың жағ ындысы жасалып қ ойылады, қ ұ рғ ақ, қ араң ғ ы жерде сақ талады. Зерттеу алдында дайын бояу жағ ындының ү стіне бір тамшы зерттелетін қ анды тамызып, жұ қ а жағ ынды жасалады. Ол ылғ ал камерағ а 3-4 минутқ а салынады, сонан соң ауағ а кептіріп, микроскоппен иммерсия жү йесінде зерттеледі. Жағ ындыда эритроциттер сары-жасыл тү сті, дә некті-жіпшік субстанциясы – кө к тү сті.