Практична робота. Дослід 1. Визначення вмісту сечовини в сечі.

Дослід 1. Визначення вмісту сечовини в сечі.

Принцип методу. Метод базується на здатності сечовини, що містить аміногрупи, утворювати з парадиметиламінобензальдегідом в кислому середовищі комплексну сполуку, забарвлену в жовтий колір. Інтенсивність забарвлення прямо пропорційна концентрації сечовини в досліджуваній сечі і визначається фотоколориметрично.

Матеріальне забезпечення: сеча; 2 %-ний розчин парадиметил-амінобензальдегіду (ПДМАБА); стандартний розчин сечовини (2, 5 %); ФЕК, піпетки, мікропіпетки, сухі пробірки.

Хід роботи. У пробірку наливають 0, 2 мл сечі, додають 1, 2 мл розчину ПДМАБА і ретельно перемішують. Через 15 хв пробу фотометрують в сухих кюветах шириною 3 мм (синій світлофільтр, λ = 450-480 нм) проти води. Показник Е для контролю – 0, 08. Для визначення вмісту сечовини в сечі користуються готовим калібрувальним графіком (0, 5; 1, 0; 1, 5; 2, 0; 2, 5 г сечовини в 100 мл) і розраховують кількість сечовини в г/добу. При побудові калібрувального графіку використовують стандартні розчини сечовини (замість сечі беруть 0, 2 мл кожного стандарту, обробляють так само, як і сечу, і аналогічно фотометрують). Коефіцієнт перерахунку в одиниці СІ (ммоль/добу) дорівнює 16, 65.

Пояснити отримані результати. Зробити висновок.

Клініко-діагностичне значення. Синтез сечовини відбувається в печінці (цитозоль і мітохондрії) головним чином з аміаку, який утворюється при дезамінуванні амінокислот, розпаді пуринових і піримідинових нуклеотидів. За добу з сечею здорової людини виділяється 20-35 г або 333-583 ммоль сечовини. В нормі вміст сечовини в сироватці крові становить 3, 3- 8, 3 ммоль/л.

Відхилення від нормального вмісту залежать від інтенсивності процесів синтезу сечовини та її виведення.

Збільшення вмісту сечовини в сироватці крові є однією з головних ознак порушення видільної функції нирок. Крім того, зростання рівня сечовини у сироватці крові може бути нениркового походження – при втраті організмом рідини (блювання, пронос, зневоднення), при посиленому розпаді білків (гостра жирова дистрофія печінки).

Зменшення вмісту сечовини може спостерігатися при захворюваннях печінки (паренхіматозна жовтяниця, цироз печінки) внаслідок порушення синтезу сечовини в печінці.

Підвищений вміст сечовини у сечі спостерігається при дефіциті білка в їжі, при злоякісній анемії, гарячці, інтенсивному розпаді білків в організмі, після прийому саліцилатів, при отруєнні фосфором.

Знижений вміст сечовини спостерігається при цирозі печінки, паренхіматозній жовтяниці, нефриті, ацидозі, уремії.

Дослід 2. Проба Фелінга. Якісна реакція на фенілпіровиноградну кислоту.

Принцип методу. Фенілпіровиноградна кислота утворює з іонами трьохвалентного феруму комплексну сполуку, забарвлену у синьо-зелений колір.

Матеріальне забезпечення: сеча хворого на фенілкетонурію, 10 %-ний розчин феруму хлориду, крапельниці, фільтри, піпетки.

Хід роботи. До 2 мл свіжовідфільтрованої сечі наливають 8-10 крапель 10% розчину FeCl₃. За наявності у сечі фенілпіровиноградної кислоти через 30-60 сек з’являється синьо-зелене забарвлення, яке зникає поступово протягом 5-30 хв в залежності від концентрації фенілпіровиноградної кислоти в сечі.

Клініко-діагностичне значення. Вроджена відсутність у дітей в печінці ферменту фенілаланін-4-монооксигенази призводить до блокування окиснення фенілаланіну в тирозин і, відповідно, всіх подальших метаболічних перетворень тирозину. Нагромадження у крові та тканинах фенілаланіну та продуктів його розпаду, в тому числі фенілпіровиноградної кислоти, викликає інтоксикацію організму. Наслідком цього є порушення нормального розвитку мозку і важкі нервові розлади. Діагностичним критерієм цього спадкового захворювання є підвищений вміст фенілаланіну в крові, наявність фенілпіровиноградної кислоти в сечі. В нормі концентрація фенілаланіну в крові дітей в середньому становить: до 1 місяця – 0, 133 ммоль/л, від 1 місяця до 1 року – 0, 095 ммоль/л, від 1 року до 14 років – 0, 115 ммоль/л.

Пробу на фенілпіровиноградну кислоту можна проводити на фільтрувальному папері. Смужку фільтрувального паперу змочують сечею, висушують на повітрі і наносять краплю 10% розчину FeCl₃. Позитивна проба дає синьо-зелене забарвлення. Аналогічну пробу можна проводити на сухій або мокрій дитячій пелюшці.

Контроль виконання лабораторної роботи

1. Який вміст сечовини у крові та сечі здорової людини? Яким методом його можна визначити?

2. За допомогою якої реакції можна діагностувати фенілкетонурію?

3. У лікарню привезли дворічну дитину. Після споживання їжі в неї часто виникає блювота. Дитина відстає у масі тіла, фізичному та розумовому розвитку. Волосся темне, але є сиве пасмо. Проба сечі після додавання FeCl₃ набула зеленого забарвлення. Результати кількісного аналізу сечі такі: вміст фенілаланіну – 7 ммоль/л за норми 0, 01; вміст фенілпірувату – 4, 8 ммоль/л за норми 0; вміст феніллактату – 10, 3 ммоль/л за норми 0. Про яке порушення метаболізму свідчать отримані дані? Що можна порекомендувати для нормалізації метаболізму стосовно лікувального харчування у цьому випадку?

4. У маленьких дітей хворих на квашіоркор у перші дні після переведення на повноцінну дієту спостерігається втрата ваги. Поясніть причину цього феномену.

Приклади тестів „Крок-1”

1. У хворого сеча має специфічний запах кленового сиропу. Який біохімічний дефект є причиною цього захворювання?

A. Порушення окиснювального декарбоксилування кетокислот з розгалуженим вуглеводневим ланцюгом

B. Порушення окиснювального декарбоксилування α -кетокислот

C. Порушення декарбоксилування глутамінової кислоти

D. Зниження активності 5-окситриптофандекарбоксилази

E. Зниження активності НАД-дегідрогенази цитрату і декарбоксилази щавелевобурштинової кислоти

2. У дитини спостерігаються порушення функцій центральної нервової системи. Клініко-біохімічними дослідженнями виявлено гіперамоніємію та уремію. Попередній діагноз – спадкова гіперамоніємія, зумовлена порушенням синтезу сечовини. Ензимопатія якого ензиму може спричинити це захворювання?

A. Глутатіонтрансферази

B. Сульфотрансферази

C. Гліцинтрансферази

D. Глюкуронілтрансферази

E. Орнітинкарбомоїлтрансферази

3. У крові пацієнта віком 50 років спостерігається високий рівень серотоніну, в сечі – різке зростання 5-оксііндолілацетатної кислоти. Порушення метаболізму якої амінокислоти може спричинити такі зміни?

A. Метіоніну

B. Триптофану

C. Глутамату

D. Фенілаланіну

E. Гістидину

4. Оксид азоту при участі складної Са²⁺-залежної ферментної системи, що називається NО-синтазою, утворюється із амінокислоти:

A. Аргініну

B. Аланіну

C. Аспартату

D. Лізину

E. Лейцину

Індивідуальна самостійна робота студентів

1. Особливості функціонування орнітинового циклу в нормі та при патології.

2. Шляхи метаболізму фенілаланіну; спадкові ензимопатії обміну фенілаланіну.

Література

Основна:

1. Губський Ю. І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – С.242-270.

2. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – С.419-435.

3. Практикум з біологічної хімії / За ред. О.Я. Склярова. – К.: Здоров’я, 2002. – С.153-167.

4. Біологічна хімія. Тести та ситуаційні задачі / За ред. О.Я. Склярова. – Київ: Медицина, 2010. – С.193-203.

5. Скляров О.Я., Сольскі Я., Великий М.М. та ін.. Біохімія ензимів. Ензимодіагностика. Ензимопатологія. Ензимотерапія. – Львів: Кварт, 2008. – 218 с.

6. Клінічна біохімія: Підручник / За ред. проф. Склярова О.Я. – Львів, 2006. – С.82-116.

Додаткова:

1. Біохімічні показники в нормі і при патології. Довідник / За ред. Склярова О.Я. – Київ: Медицина, 2007. – 318 с.

2. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1998. – С. 446-468.

3. Гуревич К.Г., Шимановський Н.Л. Оксид азота: биосинтез, механизмы действия, функции // Вопросы биол. медиц. и фармацевт. химии, 2000. – №4. – С.16-56.

4. Кольман Я., Рем К.-Г. Наглядная биохимия. – М.: Мир, 2000. – С. 182-187.

5. Кононов И.Н., Журбина А.И., Филимонов А.Ю. Аргинин в медицинской практике (Обзор лит.) // Журн. АМН України, 2004. – Т. 10, № 2. – С. 339-351.

6. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека. – М.: Мир, 1993. – Т. 1. – С. 311-355.

7. Меркулова Ю.В., Чайка Л.А., Гомон О.Н., Белостоцкая Л.И. Фармакологические основы фармакотерапии гипераммониемии // Фармакологічний вісник, 1998. – № 6. – С. 13-18.

8. Мещишен І.Ф., Яремій І.М. Особливості обміну речовин у дітей. – Чернівці: БДМА, 2003. – С. 4-18.

9. Пентюк О.О., Луцюк М.Б., Постовітенко К.П. та ін. Гіпергомоцистеїнемія // Досягнення біол. та медицини, 2004. – №1. – С. 35-38

Тема № 10. Специфічні шляхи обміну амінокислот. Дослідження проміжних продуктів біосинтезу порфіринів та їх накопичення при порфіріях.

Мета заняття: Знати шляхи обміну сірковмісних амінокислот, аргініну та триптофану. Проаналізувати методи визначення гемоглобіну, виконати бензидинову пробу і виявити гемінову групу гемоглобіну як пробу на мінімальну кількість крові в біологічному матеріалі.

Актуальність теми: Специфічний обмін амінокислот відіграє суттєву роль у загальному обміні речовин як клітини, так й організму. У результаті обміну амінокислот утворюються біологічно активні сполуки, які у свою чергу регулюють ряд біохімічних та та фізіологічних процесів в організмі людини. Порфірини – органічні сполуки, що беруть участь в основних процесах життєдіяльності: тканинному диханні та фотосинтезі. У вільному стані порфірини майже не зустрічаються, специфічні сполуки порфіринів представлені комплексами, які складаються з білків і металів.

Гемопротеїни – комплекси заліза з порфіринами і білком – є представниками різноманітних сполук, функція яких пов’язана з обміном кисню. Одна з груп гемопротеїнів є дихальними ферментами. До них належать каталаза, пероксидази, цитохроми. Друга група гемопротеїнів, які переносять і депонують кисень, представлена гемоглобіном, міоглобіном. Накопичення їх в організмі вище норми викликає підвищену світлочутливість шкірних покривів.

Конкретні завдання:

Ø Пояснювати особливості функціонування загальних шляхів метаболізму амінокислот та спеціалізованих перетворень сірковмісних амінокислот та триптофану.

Ø Трактувати використання амінокислот як попередників у біосинтезі гему.

Ø Знати біохімічні функції гемопорфіринів: гемоглобіну, міоглобіну, цитохромів.

Ø Обумовити основні етапи синтезу порфіринів на прикладі гему.

Ø Пояснити процеси розвитку порфірій.

Теоретичні питання

1. Обмін сірковмісних амінокислот; реакції метилування. Роль S – аденозилметіоніну у реакціях трансметилювання.

2. Обмін аргініну; біологічна роль оксиду азоту, NO – синтаза.

3. Обмін триптофану: кінуреніновий та серотоніновий шляхи.

4. Порфірини. Структура порфіринів.

5. Синтез порфіринів, схема ферментативних реакцій синтезу гему. Регуляція синтезу порфіринів.

6. Спадкові порушення обміну порфіринів (ензимопатії). Клінічні прояви порфірій: світлочутливість, неврологічні порушення; Класифікація порфірій – еритропоетична (хвороба Гюнтера), печінкові порфірії, фотодерматити.