Практична робота. Дослід 1. Якісна реакція на ацетон та ацетоацетатну кислоту (проба Ланге).

Дослід 1. Якісна реакція на ацетон та ацетоацетатну кислоту (проба Ланге).

Принцип методу. Ацетон та ацетоацетатна кислота з натрію нітропрусидом у лужному середовищі утворюють продукти реакції, забарвлені у червоний колір:

CH₃ – CO – CH₃ + Na₂ [Fe (CN)₅ NO] + 2 NaOH →

→ Na₄ [Fe (CN)₅ NO = CHCOCH₃] + 2 H₂O.

Під дією концентрованої ацетатної кислоти утворюється продукт вишнево-червоного кольору:

Na₄ [Fe (CN)₅ NO =CHCOCH₃] +CH₃COOH →

Na₃ [Fe (CN)₅ NOCH₃COCH₃] + CH₃COONa.

Ацетоацетатна кислота (в енольній формі) здатна також утворювати з ферумом хлориду (III) комплексну сполуку вишнево-червоного кольору.

Матеріальне забезпечення: сеча хворого на цукровий діабет та сеча здорової людини, 10 % розчин натрію нітропрусиду (свіжоприготований), крижана ацетатна кислота, 10 % розчин NaOH, 50 % розчин амонію сульфату, концентрований розчин аміаку, 10 % розчин феруму хлориду (ІІІ), піпетки, пробірки, лійка, фільтрувальний папір.

Хід роботи. 1. Реакція з натрію нітропрусидом (проба Ланге). В4 пробірки наливають по 0, 5 мл досліджуваної сечі, додають по 0, 5 мл розчину натрію гідроксиду і 5-7 крапель натрію нітропрусиду. Спостерігають за появою червоного забарвлення, що приймає вишневий відтінок після додавання декількох крапель концентрованої ацетатної кислоти.

2. Реакція з феруму хлоридом (III) (проба Герхарда).

В 4 пробірки наливають по 2, 0 мл досліджуваної сечі і додають по краплям 10 % розчин феруму хлориду (III) до припинення утворення осаду фосфатів. Осад відфільтровують, до фільтрату додають ще декілька крапель FeCl₃ та спостерігають за появою вишневого забарвлення.

Зробити висновок.

Дослід 2. Кількісне визначення кетонових тіл у сечі.

Принцип методу. Див. попередній дослід.

Матеріальне забезпечення: див. попередній дослід.

Хід роботи. Беруть 8 пробірок. У всі, крім першої, наливають по 1мл дистильованої води. У першу та другу пробірки додають по 1 мл сечі хворого на цукровий діабет. Таким чином, у першій пробірці сеча не розведена, а в другій розведена у двічі. Після перемішування з другої пробірки відбирають 1 мл суміші і переносять у третю пробірку, з третьої в четверту і т. д. З останньої пробірки 1 мл виливають для вирівнювання об’єму з іншими пробірками. Таким чином, сеча у пробірках буде розведеною у 2, 4, 8 (і т. д.) разів.

Потім у кожну пробірку додають по 8 крапель 50 % розчину амонію сульфату для збільшення густини розчинів по 8 крапель ацетатної кислоти (концентрованої) та натрію нітропрусиду. Вміст пробірок перемішують і у кожну з них обережно по стінках, починаючи з останньої пробірки, нашаровують по 1 мл концентрованого аміаку (реактив відбирати обережно лише за допомогою гумової груші, працюючи з ним під витяжною шафою). Спостерігаючи за пробірками, позначають ту з них, у якій при максимальному розведенні сечі впродовж 3-4 хв ще помітне фіолетове кільце на межі рідин. Звернути увагу, що для успішного проведення досліду аміак необхідно нашаровувати обережно, по стінках. Акцентувати увагу на термін утримання фіолетового кільця.

Розрахунок проводять за формулою:

Х = 0, 85 ´ А ´ 15,

де Х – концентрація ацетону в сечі, мг/добу;

0, 85 – емпіричне число;

А – розведення сечі;

15 – перерахунок на добову сечу 1500 мл.

Після проведення розрахунків зробити висновок.

Клініко-діагностичне значення. У здорової людини в крові вміст кетонових тіл – 1, 3-185 мкмоль/л (1, 5-20 мг/л), з сечею виділяється 20-40 мг на добу. Це переважно ацетоацетатна і b-оксимасляна кислоти. Різке зростання концентрації кетонових тіл супроводжується порушенням кислотно-основного стану і розвитком метаболічного кетоацидозу, що є небезпечним, в першу чергу, для нормального функціонування клітин головного мозку.

Підвищення концентрації кетонових тіл у крові (кетонемія) і появу їх у сечі (кетонурія) спостерігають при цукровому діабеті, тиреотоксикозі, ураженні печінки, важких інтоксикаціях, голодуванні. Зниження концентрації кетонових тіл не має клінічного значення.

Контроль виконання лабораторної роботи

1. У чому полягає принцип методу визначення кетонових тіл (проба Ланге)?

A. У здатності ацетону утворювати фіолетове кільце з натрію нітропрусидом при нашаруванні аміаку

B. В утворенні забарвлених продуктів конденсації з оксиметилфурфуролом

C. У здатності утворювати дрібнодисперсну емульсію

D. В утворенні забарвленого триметинового комплексу при реакції з тіобарбітуровою кислотою

E. У здатності за присутності ацетатного ангідриду і суміші ацетатної і сульфатної кислот утворювати сполуку зеленого кольору

2. Вказати вміст кетонових тіл в крові у нормі:

А. 2, 5-8 мкмоль/л

В. 0-2, 5 мкмоль/л

С. 180-250 мкмоль/л

Д. 13-185 мкмоль/л

Е. 205-317 мкмоль/л

3. Для підвищення результатів спортсмену рекомендували застосовувати препарат, який містить у собі карні тин. Який процес в найбільшому ступені активується карнітином?

А. Транспорт жирних кислот до мітохондрій

В. Синтез кетонових тіл

С. Синтез стероїдних гормонів

Д. Синтез ліпідів

Е. Тканинне дихання

4. На чому ґрунтується виявлення кетонових тіл за пробою Герхардта?

A. На здатності утворювати червоне забарвлення з оксиметилфурфуролом

B. На здатності утворювати із ферумом хлориду (Ш) сполуку червоного кольору

C. На окисненні бензидину киснем

D. На утворенні феруму лактату жовто-зеленого кольору

E. На здатності утворювати червоне забарвлення з діазореактивом

5. У раціоні людини відсутні рослинні олії. До яких наслідків це може призвести?

6. У крові людини виявлено високу концентрацію вільних жирних кислот. Які причини цього явища?

7. У добовій сечі виявлено 120 мг кетонових тіл. Які причини і наслідки такого стану для організму?

Приклади тестів „Крок-1”

1.Жири є необхідним енергетичним матеріалом для організму. Який основний шлях перетворення жирних кислот у мітохондріях клітини?

А. b-Окиснення

В. Декарбоксилювання

С. Відновлення

Д. a-Окиснення

Е. g-Окиснення

2. При цукровому діабеті та голодуванні в крові збільшується вміст ацетонових тіл, які використовуються як енергетичний матеріал. Назвіть речовину, з якої вони синтезуються?

А. Ацетил-КоА

В. Цитрат

С. Сукциніл-КоА

Д. a-Кетоглутарат

Е. Малат

3. Після тривалого голодування у крові людини спостерігається підвищення вмісту кетонових тіл. Це зумовлено:

А. Збільшенням окиснення жирних кислот в печінці

В. Мобілізацією ліпопротеїнів високої густини

С. Утворенням ацетил-КоА

Д. Зниженням рівня вільних жирних кислот у сироватці крові

Е. Зниженням мобілізації триацилгліцеролів в жировій тканині

4. У хворого на цукровий діабет у крові виявлено ацетон. Яким чином він утворюється в організмі?

А. При конденсації двох молекул ацетил-КоА

В. У процесі b-окиснення жирних кислот

С. У процесі a-окиснення жирних кислот

Д. У процесі g-окиснення жирних кислот

Е. У циклі Кребса

Індивідуальна самостійна робота студентів

1. Патології, пов’язані з порушенням ліпідного обміну.

Література

Основна:

1. Губський Ю. І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – С.194-209.

2. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – С.366-378.

3. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1998. – С.292-305.

4. Біологічна хімія. Тести та ситуаційні задачі. / За ред. О.Я. Склярова. – Київ: Медицина, 2010. – С.87-106.

5. Клінічна біохімія. / За ред. проф. Склярова О.Я. – Львів, 2006. – С. 63-79.

6. Біохімічні показники в нормі і при патології. Довідник / За ред. Склярова О.Я. – Київ: Медицина, 2007. – С.102-111.

Додаткова:

1. Скляров О.Я., Сергієнко О.О., Фартушок Н.В. та ін. Обмін вуглеводів. Біохімічні та клінічні аспекти. – Львів: Світ, 2004. – 111с.

2. Колосова Н.Г. Возрастные изменения окислительности белков и липидов в печени преждевременно стареющих крыс // Биомед. химия. – 2004. – Т. 50, № 1. – С. 73 – 78.

3. Кольман Я., Рем К.-Г. Наглядная биохимия. – М.: Мир, 2000. – 469 с.

Тема № 7. Біосинтез та біотрансформація холестеролу. Патології ліпідного обміну: стеаторея, атеросклероз, ожиріння. Транспортні форми ліпідів – ліпопротеїни плазми крові.

Мета заняття: Вивчити шляхи біотрансформації холестеролу та основні порушення ліпідного обміну. Зрозуміти природу вільнорадикальних реакцій, механізми реакцій пероксидного окиснення ліпідів (ПОЛ) та значення їх у біологічних процесах у нормі та при патології.

Актуальність теми: Порушення процесів біотрансформації холестеролу зумовлює ряд захворювань, серед яких атеросклероз, ожиріння та інші. Тому дослідження показників ліпідного обміну є необхідним для діагностики та лікування різних захворювань.

Утворення вільних радикалів та продуктів ПОЛ є необхідною ланкою в нормальному метаболізмі. У нормі інтенсивність процесів ПОЛ регулюється системою антиоксидантного захисту. Порушення співвідношення між активністю про- і антиоксидантних систем проявляється у вигляді різних патологічних процесів, що і пояснює необхідність їх вивчення.

Конкретні завдання:

Ø Трактувати етапи біосинтезу холестеролу.

Ø Пояснювати регуляцію синтезу холестеролу в організмі людини.

Ø Аналізувати шляхи біотрансформації холестеролу: етерифікацію, утворення жовчних кислот, стероїдних гормонів, вітаміну D₃; екскреція холестеролу з організму.

Ø Пояснювати патології ліпідного обміну: атеросклероз, цукровий діабет, ожиріння, стеаторею.

Ø Пояснювати процеси ліпідної пероксидації за умов норми та патології.

Ø Трактувати регуляцію вільнорадикальних реакцій в організмі людини.

Теоретичні питання

1. Біосинтез холестеролу в організмі людини:

· локалізація цього процесу, значення;

· етапи синтезу холестеролу;

· ферментативні реакції синтезу мевалонової кислоти;

· регуляція синтезу холестеролу.

2. Шляхи біотрансформації холестеролу (етерифікація, утворення жовчних кислот та стероїдних гормонів, синтез вітаміну D₃, екскреція з організму).

3. Патології ліпідного обміну:

• атеросклероз: механізми розвитку, роль генетичних факторів, гіперхолестеринемії, класифікація ВООЗ;
• порушення ліпідного обміну при цукровому діабеті;
• патологічні процеси обміну ліпідів, які ведуть до розвитку ожиріння;
• жировий гепатоз, ліпотропні фактори.

6. Процеси пероксидного окиснення ліпідів та механізми дії ензимів антиоксидантного захисту:

• процеси ліпідної пероксидації в нормі та за умов патології;
• регуляція вільнорадикальних реакцій в організмі людини;
• характеристика антиоксидантів та прооксидантів, їх значення для перебігу реакцій пероксидації ліпідів.

7. Будова ліпопротеїнів крові.

8. Особливості метаболізму ліпопротеїнів крові.