Практична робота. Дослід 1. Використання неорганічного фосфору дріжджовими клітинами в процесі їх бродіння.

Дослід 1. Використання неорганічного фосфору дріжджовими клітинами в процесі їх бродіння.

У процесі спиртового бродіння, так як і при гліколізі, проходить фосфоролітичний розпад вуглеводів, що призводить до утворення як проміжних сполук, фосфорних ефірів тріоз і гексоз, а також і до утворення АТФ. При фосфорилуванні цих сполук зв’язується неорганічний фосфат, концентрація якого в розчині зменшується. За інтенсивністю зменшення кількості неорганічного фосфору можна судити про інтенсивність процесів фосфорилування.

Принцип методу. Фосфати в розчині сульфатної кислоти утворюють з молібдатами фосфорно-молібденові комплекси, які редукуються аскорбіновою кислотою до молібденової синьки. Кількість фосфатів визначають колориметрично на ФЕKу.

Матеріальне забезпечення: сухі дріжджі, порошок глюкози, або сахарози, стандартний розчин фосфату (10 мг фосфору/мл), фосфатний буфер (6 г Na₂HPO₄ · 2H₂O та 2 г KH₂PO₄ на 1 л H₂O – рН 7, 2), 0, 1 н розчин СН₃СООН, молібденовий реактив (суміш (NH₄)₂МоО₄ i Fe(HSO₄)₂), 0, 5 % розчин аскорбінової кислоти, дистильована вода, штатив з пробірками, лійки, фільтри, ступка з товкачиком, водяна баня (37^о С), термометр, ФЕК.

Хід роботи. 1. Приготування бродильної суміші. В ступці розтирають 1 г сухих дріжджів з 5-а мл дистильованої води, отримуючи дріжджову суспензію. В чисту пробірку вносять 2 г глюкози, або сахарози, додають 5 мл фосфатного буферу (рН 7, 2) і ставлять у водяну баню при температурі 37-38⁰ С. Після розчинення глюкози або сахарози в фосфатному буфері до розчину додають 4 мл дріжджової суспензії та добре перемішують.

2. Дослідження в часі швидкості зв’язування неорганічного фосфору у пробах, взятих з бродильної суміші. Піпеткою набирають 1 мл бродильної суміші і вносять у чисту пробірку. Бродильну суміш, яка залишилась, ставлять у водяну баню при 37-38^оС на 90 хв, відбираючи в чисті пробірки по 1 мл бродильної суміші кожні 30 хв.

а) Осадження дріжджових клітин. До 1 мл бродильної суміші додають 3 мл 0, 1 н розчину СН₃СООН. У слабкокислому середовищі (рН близьке до ізоелектричної точки) дріжджові клітини випадають в осад. Останні видаляють фільтруванням через сухий фільтр.

б) Розведення фосфатів. До 1 мл фільтрату додають 19 мл дистильованої води (1: 20). З розведеного в 20 разів фільтрату відбирають піпеткою 1 мл і вносять у чисту пробірку, та додають 4 мл дистильваної води, отримуючи кінцеве розведення в 100 разів. Процедури (а) і (б), які описані вище, повторюють ще 3 рази, відбираючи кожні 30 хв по 1 мл бродильної суміші з пробірки, яка інкубується в водяній бані при 37-38^о С.

в) Колориметрування розчинів. Після відбору і обробки всіх чотирьох проб у кожну пробірку додають по 4, 5 мл молібденового реактиву та по 0, 5 мл 0, 5 % розчину аскорбінової кислоти. Розчини в пробірках перемішують і не раніше, ніж через 2 хв, але не пізніше ніж через 5 хв, вимірюють оптичну густину на ФЕКу, при l = 750 нм. Отримані величини 4 проб записують.

Побудова калібрувального графіку.

У 4 пробірки вносять розчини в мл, як вказано нижче в таблиці. В 5-й лінійці приведені концентрації фосфору в мг% та ммоль/л, а в 6-й записують отримані на ФЕКу величини оптичних густин.

За результатами вимірів оптичних густин будують калібрувальний графік, відкладаючи на осі ординат отримані оптичні гуcтини, а на осі абсцис концентрацію фосфору в ммоль/л.

Оптична [Р] мг%

густина

[ А]

0, 3 300

0, 2 200

0, 1 100

50 100 200 10 20 30 40 50 60

концентрація [Р] мг% хв

Калібрувальний графік залежності концентрації неорганічного фосфату від часу інкубації

Користуючись калібрувальним графіком, за величинами оптичних густин досліджуваних проб знаходять у них концентрацію фосфору.

З отриманих даних будують графік залежності концентрації неорганічного фосфору від часу інкубації (концентрацію неорганічного фосфору в ммоль/л відкладають на осі ординат, час інкубації в хвилинах – на осі абсцис).

Зробити висновок.

Дослід 2. Кількісне визначення молочної кислоти в сироватці крові за методом Бюхнера.

Молочна кислота в організмі є кінцевим продуктом гліколізу і глікогенолізу – анаеробних процесів окиснення глюкози та глікогену. Значна кількість молочної кислоти утворюється в м’язах, поступає в кров, переноситься до серцевого м’яза та в печінку, де окиснюється.

Принцип методу. Молочна кислота при нагріванні з концентрованою сульфатною кислотою перетворюється в оцтовий альдегід, який при взаємодії з гідрохіноном утворює сполуку червоно-коричневого кольору. Кількість молочної кислоти визначають колориметрично на ФЕКу при синьому світлофільтрі (l = 380 нм).

Матеріальне забезпечення: сироватка крові, 5 % розчин метафосфорної кислоти, 10 % розчин міді сульфату, кальцію гідроксид в порошку, концентрована сульфатна кислота, 20 % розчин гідрохінону, стандартний розчин молочної кислоти, дистильована вода, пробірки з притертими корками на 15 мл, скляні лійки, скляні палички, фільтри, водяна баня, газовий пальник, ФЕК.

Хід роботи. У дві сухі пробірки наливають по 6 мл дистильованої води. Потім в першу додають 1 мл стандартного розчину молочної кислоти, в другу – 1 мл сироватки крові. Для осадження білків вносять в кожну пробірку по 1 мл метафосфорної кислоти, струшують та залишають на кілька хвилин, після чого відфільтровують. До фільтратів додають по 1 мл 10 % розчину міді сульфату та по 0, 5 г кальцію гідроксиду. Проби перемішують скляними паличками, через 5 хв відфільтровують. Відмірюють по 1 мл фільтрату в пробірки з притертими корками, додають по 0, 1 мл 10 % розчину міді сульфату та по 4 мл концентрованої сульфатної кислоти. Пробірки ставлять у киплячу водяну баню на 1, 5 хв. Після охолодження додають по 0, 1 мл 20 % спиртового розчину гідрохінону, добре перемішують та кип’ятять 15 хв. Пробірки охолоджують та колориметрують при синьому світлофільтрі (l = 380 нм).

Розрахунки: Концентрацію молочної кислоти розраховують за формулою:

С_СТАНД. · А_{ДОСЛІДУ}

С =

А_СТАНД,

де С – концентрація молочної кислоти в сироватці крові, ммоль/л.

С_СТАНД. – концентрація молочної кислоти в стандартному розчині.

А_СТАНД. – оптична густина стандартного розчину молочної кислоти.

А_{ДОСЛІДУ} – оптична густина дослідної проби.

Оцінити отриманий результат. Зробити висновок.

Клініко-діагностичне значення. Концентрація в крові здорової людини молочної кислоти становить 1 - 2 ммоль/л. Збільшення вмісту молочної кислоти може бути пов’язане з виконанням людиною інтенсивної м’язової праці за короткий проміжок часу без достатнього надходження кисню. При цьому не проходить в достатній мірі окисне декарбоксилування пірувату до ацетил-КоА, а тільки утворення лактату. Останній може використатися у відновному періоді при достатньому надходженні кисню. Збільшення концентрації молочної кислоти спостерігається при гострому гнійному запальному уражені тканин, важкій анемії, епілепсії, тетанії, правці, гіпоксії, пов’язаній з серцевою та легеневою недостатністю, злоякісних новоутвореннях, захворюваннях печінки (гострих гепатитах, цирозі печінки), цукровому діабеті, нирковій недостатності, гострому септичному ендокардиті, поліомієліті, лейкозах, інтенсивних і тривалих м’язових навантаженнях та ін.

Для більшості наведених станів (лактоацидоз) збільшується співвідношення лактат / ПВК, найчастіше воно становить 10: 1.

Контроль виконання лабораторної роботи

1. При яких патологічних станах кількість молочної кислоти збільшується в крові?

А. Цукровому діабеті

В. Анемії

С. Інфаркті міокарду

D.Гепатитах

Е. Епілепсії

2. З метою встановлення концентрації молочної кислоти в крові користуються методом, принцип якого полягає у:

А. Відновленні солей важких металів у лужному середовищі

В. Визначенні інтенсивності забарвлення сполуки, що утворилася за взаємодії глюкози з ортотолуїдином

С. Дії ферменту глюкозооксидази, яка окиснює глюкозу до глюконової кислоти киснем повітря

D. Відновленні двовалентних іонів міді в одновалентні

Е. Фотометруванні забарвленого комплексу, що утворився в процесі взаємодії з концентрованою сульфатною кислотою та гідрохіноном

3. Хворий знаходиться в стані шоку. Вміст молочної кислоти в крові 10 ммоль/л. Оцініть цей показник. До яких наслідків це може призвести?

4. У хворого виявлено підвищення активності ЛДГ₁, ЛДГ₂ і креатинкінази. В якому органі можливий розвиток патологічного процесу?

5. У спортсмена після змагань підвищився вміст молочної кислоти в крові. Чи можна вважати це патологією? Відповідь обґрунтуйте.

Приклади тестів “Крок -1”

1. Гліколіз – це анаеробний шлях розпаду глюкози, що відбувається за допомогою низки послідовних реакцій. Вкажіть яку реакцію гліколізу каталізує ензим фосфофруктокіназа?

А. Утворення глюкозо-6-фосфату

В. Утворення фруктозо-1-фосфату

С. Утворення фруктозо-1, 6-дифосфату

D. Утворення диоксиацетонфосфату

Е. Утворення 1, 3-дифосфогліцерату

2. Вкажіть реакції гліколізу, що протікають із затратою енергії у вигляді АТФ

A. Альдолазна, фосфофруктокіназна

B. Піруваткіназна, гексокіназна

C. Гексокіназна, фосфофруктокіназна

D. Фосфогліцераткіназна, гексокіназна

E. Піруваткіназна, фосфогліцеромутазна

3. В експерименті показано, що при саркомі Ієнсена споживання глюкози з привідної до пухлини артерії значно збільшується, має також місце приріст вмісту молочної кислоти у відвідній артерії. Про що свідчить дане явище?

A. Посилення анаеробного гліколіз у D. Посилення окисних процесів

B. Посилення окиснення білків E. Зменшення анаеробного гліколізу

C. Зменшення окисних процесів

4. У крові хворого виявлено підвищення цукерок у змішаній слині тимчасово підвищується рівень лактату. Активація якого біохімічного призводить до цього?

А. Анаеробного гліколізу D. Глюконеогенезу

В. Тканинного дихання Е. Мікросомного окиснення

С. Аеробного гліколізу

5. У дріжджоподібних організмів відбувається процес близький до гліколізу – спиртове бродіння, в результаті якого через ряд послідовних стадій із пірувату утворюється

A. Лактат D. Гліцеральдегід

B. Етанол E. Піруват

C. Ацетальдегід

Індивідуальна самостійна робота студентів.

1. Принципи регуляції обміну глюкози.

2. Характеристика регуляторних ферментів гліколізу (особливості активації та інгібування).

Література

Основна:

1. Губський Ю.І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – С. 143 – 154.

2. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – С. 300 – 308.

3. Скляров О.Я., Сергієнко О.О., Фартушок Н.В. та ін. Обмін вуглеводів. Біохімічні та клінічні аспекти. – Львів: Світ, 2004. – 111с.

4. Клінічна біохімія/ За ред. проф.Склярова О.Я.- К.: «Медицина», 2006. – С. 101 – 103.

5. Біохімічні показники в нормі і при патології. Довідник / За ред. Склярова О.Я. – К.: Медицина, 2007. – 318с.

6. Біологічна хімія. Тести та ситуаційні задачі / За ред. Склярова О.Я. –К.: ВСВ «Медицина», 2010. – С. 62 – 84.

7. Біохімічний склад рідин організму та їх клініко-діагностичне значення / За ред. проф. Склярова О.Я., Київ: Здоров'я, 2004. -191с.

8. Біохімія ензимів. Ензимодіагностика. Ензимопатологія. Ензимотерапія: Посібник / Скляров О., Сольскі Я., Великий М. та ін. – Львів: Кварт. – 2008. –С. 38 -46.