Практична робота. Дослід 1. Кількісне визначення активності амілази сечі за методом Вольгемута.

Дослід 1. Кількісне визначення активності амілази сечі за методом Вольгемута.

Принцип методу. Метод Вольгемута грунтується на здатності амілази розщеплювати (гідролізувати) крохмаль. В ході роботи виявляють мінімальну кількість ферменту, здатного повністю розщеплювати 1 мл 0, 1 %-го розчину крохмалю. Цю кількість ферменту приймають за одиницю амілазної активності.

Амілазна активність виражається в кількості мл 0, 1 %-го розчину крохмалю, яку може розщепити (гідролізувати) 1 мл нерозведеної сечі при температурі 45^оС протягом 15 хв.

Матеріальне забезпечення: сеча, 0, 1 % р-н крохмалю, 0, 1 % розчин I₂ в 0, 2 % розчині KI, 0, 85 % р-н NaCl, газовий пальник, водяна баня, штатив з пробірками, піпетки.

Хід роботи. У дев’ять пронумерованих пробірок вносять з бюретки по 1 мл 0, 85 % р-н NaCl. У першу пробірку додають 1 мл сечі. Вміст добре перемішують і 1 мл отриманого розчину переносять з першої пробірки до другої, з неї – в третю, таким чином у кожній наступній пробірці вміст ферменту в два рази менше, ніж у попередній. З останньої пробірки 1 мл суміші виливають для зрівняння об’єму. Потім в усі пробірки додають ще по 1 мл 0, 85% р-н NaCl та по 2 мл 0, 1%-го розчину крохмалю, перемішують та ставлять пробірки у водяну баню (чи термостат) при 45°С на 15 хв.

Після інкубації пробірки виймають та охолоджують для зупинки дії ферменту. В кожну пробірку додають по 2 краплі розчину йоду (0, 1%-ний розчин йоду в 0, 2 %-му розчині йодиду калію), перемішують та спостерігають за зміною забарвлення. Рідина в пробірках може забарвлюватися у жовтий, червоний та синій колір. Жовтий колір свідчить про повне розщеплення крохмалю. Результати спостережень вносять в таблицю, позначаючи синє, червоне та жовте забарвлення літерами “С”, “Ч”, “Ж”. Відмічають останню пробірку з розчином жовтого кольору та проводять розрахунок амілазної активності в сечі:

Приклад розрахунку активності амілази в сечі: остання пробірка з розчином жовтого кольору виявляється четвертою, в ній сеча розведена у 16 разів. Складають пропорцію та розраховують активність амілази:

1/16 мл сечі розщеплює 2 мл 0, 1 %-го розчину крохмалю;

1мл сечі розщеплює - Х мл 0, 1 %-го розчину крохмалю,

звідки X = ^{1 × 2_} = ^{2 × 16} = 32 мл

^{1/16 1}

А отже: А (амілазна активність) = 32 одиниці.

Зробити висновки з проведених досліджень.

Клініко-діагностичне значення. Метод Вольгемута широко використовується в клінічній практиці для визначення амілазної активності в крові та сечі. У нормі активність амілази сечі коливається в межах 16-18 одиниць. При гострих панкреатитах активність амілази сечі та сироватки крові зростає в 10-30 разів, особливо протягом першої доби захворювання, потім поступово повертається до норми.

Дослід 2. Кількісне визначення активності пептидаз панкреатину.

Принцип методу. Метод ґрунтується на здатності пептидаз гідролізувати пептидні зв’язки, що приводить до зростання кількості вільних аміно- та карбоксильних груп. Після блокування аміногруп формаліном, карбоксильні групи підвищують кислотність середовища, приріст якого визначається титруванням лугом за методом Зернсена в присутності індикатора фенолфталеїну.

Матеріальне забезпечення: 6 % розчин казеїну, фосфатний буфер рН 7, 6, панкреатин, фенолфталеїн, 0, 2 н розчин NaОН, 0, 02н розчин NaОН, формольна суміш рН 8, 3, штатив з пробірками, піпетки, колбочки для титрування, бюретка, водяна баня, термометр, газовий пальник.

Хід роботи. У дві пробірки відмірюють по 5 мл 6 % розчину казеїну і по 2 мл фосфатного буферу рН 7, 6. В одну з пробірок додають 0, 5 г панкреатину, старанно перемішують і ставлять у водяну баню при температурі 37⁰С разом з контрольною пробіркою.

Через 30 хв пробірки знімають з бані, охолоджують, їх вміст переливають у колбочки для титрування, додають в кожну по 2-3 краплі фенолфталеїну і підлужнюють з піпетки 0, 2 н розчином NaОН до утворення блідорожевого забарвлення (рН-8, 3).

При такому рН кількість аміногруп у розчині дорівнює кількості карбоксильних груп. Далі в обидві колбочки додають по 5 мл формольної суміші (рН-8, 3). Формалін зв’язує аміногрупи, а карбоксильні групи зсувають рН розчину в кислу сторону. Розчин знебарвлюється. Обидві проби титрують із бюретки 0, 02 н розчином NaOH до утворення слабо-рожевого забарвлення (рН 8, 3) і додають ще декілька крапель 0, 02 н розчину NаОН до яскраво червоного кольору (рН 9, 1).

Вираховують різницю між даними титрування досліджуваного і контрольного розчинів. Активність пептидаз виражають в умовних одиницях. Одна умовна одиниця відповідає 1 мл 0, 02 н розчину NаОН, затраченого додатково на титрування дослідної проби.

Приклад розрахунку:

Кількість 0, 02 н NаОН, що пішла на титрування гідролізату казеїну............. мл.

Кількість 0, 02 н NаОН, що пішла на титрування контрольного розчину...…. мл.

Різниця у кількості 0, 02 н NaOH між дослідним і контр. розчином................. мл.

Пояснити отриманий результат. Зробити висновок.

Клініко-діагностичне значення. У нормі активність пептидаз сироватки крові становить 0, 2-1, 7мкмоль/мл год. Збільшення вмісту пептидаз у сироватці крові та зростання їх активності спостерігається при гострому панкреатиті, виразковій хворобі, обширних опіках, гострому гепатиті. Зниження активності пептидаз може спостерігатися при емфіземі легень, цирозі печінки.

Контроль виконання лабораторної роботи

1. Катал – одиниця активності ферменту, яка виражає:

А. Кількість ферменту, що каталізує перетворення 1 мкмоля субстрату за 1 хвилину

В.Кількість ферменту, що каталізує перетворення 1 мкмоля субстрату за 1 секунду

С. Число одиниць ферментативної активності, що припадає на 1 мг білка

D. Кількість молекул субстрату, що перетворюється однією молекулою ферменту за хвилину

Е. Кількість ферменту, що каталізує перетворення 1 моля субстрату за 1 секунду.

2. Яке явище лежить в основі механізму дії ферментів?

А. Утворення фермент-субстратного комплексу

В. Зближення груп, що входять до активного центру ферментів

С. Зміна просторової конфігурації

D. Зниження електричного заряду ферменту

Е. Гідроліз ферменту

3. Пептидази каталізують розщеплення:

А. Ліпідів

Б. Нуклеїнових кислот

В. Полісахаридів

D. Поліпептидів

Е. Олігосахаридів

4. До пептидаз відносять наступні ферменти:

А. Уреазу

В. АТФазу

С. РНК-полімеразу

D. Амілазу

Е. Трипсин

5. У сироватці крові хворого виявлено різке підвищення активності трипсину, α -амілази, ліпази. Про яке захворювання можна говорити?

A. Холестаз

B. Хронічний гепатит

C. Злоякісні новоутворення

D. Гострий панкреатит

E. Отруєння інсектицидами

6. В підшлунковій залозі знаходяться ферменти: амілаза, пептидази та ліпази. Які з цих ферментів за певних умов може викликати автоліз органу і чому?

7. У хворого гострий панкреатит. Які препарати повинен призначити лікар, щоб уникнути автолізу підшлункової залози?

8. Попадання в організм метилового спирту в кількості біля 30мл є дуже токсичним і може призвести до смерті. Отруйний для організму не сам метанол, а його продукт – формальдегід, який утворюється за участі алкоголь-дегідрогенази. Одним з методів в лікуваннях при цьому є введення надмірної кількості етилового спирту. Поясніть, на чому основана така лікувальна дія.

9. Поясніть основні принципи визначення активності ферментів на прикладі амілази слини (йод-крохмальна реакція та реакція Тромера).

10. Поясніть механізм перетворення субстрату за умов каталітичної дії ферменту.

Приклади тестів “Крок-1”

1. Під час операції у хворого після введення препарату, який викликає розслаблення м’язів спостерігається тривала зупинка дихання (більше 5 хв). Недостатність якого з наведених ферментів спостерігалась?

А. Каталаза

В. Глюкозо-6-фосфатдегідрогеназа

С. Моноамінооксидаза

D. Ацетилтрансфераза

Е. Ацетилхолінестераза

2. Фармпрепарати, що містять ртуть, миш’як та інші важкі метали інгібують ферменти, які мають сульфгідрильні групи. Яку амінокислоту використовують для реактивації цих ферментів?

А. Гістидин

В. Ізолейцин

С. Цистеїн

D. Аспарагінову кислоту

Е. Гліцин

3.Протеолітичні ферменти ШКТ каталізують гідроліз білків. Вкажіть, який хімічний зв’язок вони розщеплюють:

A. Пептидний

B. Глікозидний

C. Водневий

D. Ефірний

E. Фосфодіефірний

4. Амілолітичні ферменти каталізують гідроліз полісахаридів і олігосахаридів. На який хімічний зв’язок вони діють?

A. Глікозидний

B. Складноефірний

C. Пептидний

D. Амідний

E. Фосфодіефірний

5. Ліполітичні ферменти ШКТ каталізують гідроліз ліпідів. Вкажіть хімічний зв’язок, який вони розщеплюють:

A. Складноефірний

B. Пептидний

C. Глікозидний

D. Водневий

E. Амідний

Література

Основна:

1. Губський Ю. І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – С. 86-137.

2. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – С. 66-107.

3. Практикум з біологічної хімії / За ред. О.Я. Склярова. – К.: Здоров’я, 2002. – С. 51-66.

4. Біологічна хімія. Тести та ситуаційні задачі. / За ред. О.Я. Склярова. – Київ: Медицина, 2010. – С.47-62.

5. Скляров О.Я., Сольскі Я., Великий М.М. та ін.. Біохімія ензимів. Ензимодіагностика. Ензимопатологія. Ензимотерапія. – Львів: Кварт, 2008. – С.11-26.

Додаткова:

1. Клінічна біохімія: Підручник / За ред. О.Я.Склярова. – Київ: Медицина, 2006. – 431 с.

2. Біохімічні показники в нормі і при патології / За ред. О.Я. Склярова – К.: Медицина, 2007. – 320с.

3. Ангельскі С., Якубовскі З., Домінічак М. Г. Клінічна біохімія. – Сопот, 1998. – 451 с.

4. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1990. – 528 с.

5. Кольман Я., Рем К.-Г. Наглядная биохимия. – Москва: Мир, 2000. – 470 с.

6. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека. – Москва: Мир, 2004. – С. 63-71, 79-83.

Тема № 4. Дослідження регуляції ферментативних процесів та аналіз механізмів виникнення ензимопатій. Медична ензимологія.

Мета заняття: Засвоїти основні принципи регуляції метаболічних шляхів, порушення функціонування ферментів у клітині та використання ферментів у медицині.

Актуальність теми: Ферменти є біокаталізаторами з мінливою активністю, яка змінюється при певних регулюючих впливах. У клінічній практиці ферменти застосовують як фармпрепарати, а визначення їх активності у крові та сечі необхідно для діагностики патологічних станів.

Конкретні завдання:

Ø Аналізувати шляхи та механізми регуляції ферментативних процесів, як основи обміну речовин в організмі в нормі та при патологіях;

Ø Пояснювати застосування інгібіторів та активаторів ферментів як фармпрепаратів при порушеннях обміну речовин та певних патологіях;

Ø Пояснювати зміни перебігу ферментативних процесів та накопичення проміжних продуктів метаболізму при вроджених (спадкових) та набутих вадах метаболізму – ензимопатіях;

Ø Аналізувати зміни активності індикаторних ферментів плазми крові при патологіях певних органів та тканин.

Теоретичні питання

1. Активація та інгібування ферментів. Активатори ферментів (приклади). Інгібування ферментів: зворотне, незворотне, конкурентне, неконкурентне (навести приклади).

2. Регуляція шляхом зміни каталітичної активності ферментів: алостеричні ферменти; ковалентна модифікація ферментів; протеолітична активація ферментів (обмежений протеоліз); дія регуляторних білків; циклічні нуклеотиди в регуляції ферментативних процесів.

3. Регуляція шляхом зміни кількості ферментів (конститутивні та адаптивні ферменти).

4. Ізоферменти (визначення, будова на прикладі лактатдегідрогенази та креатинфосфокінази). Використання ізоферментів для діагностики.

5. Ензимодіагностика (визначення). Зміни активності ферментів плазми та сироватки крові як діагностичні (маркерні) показники розвитку патологічних процесів (інфаркту міокарда, захворювання печінки, підшлункової залози, м’язової тканини).

6. Ензимопатологія (визначення). Вроджені (спадкові) та набуті вади метаболізму, (приклади, їх клініко-лабораторна діагностика).

7. Ензимотерапія (визначення). Використання ферментів, кофакторів та інгібіторів ферментів (ацетилсаліцилова кислота, алопуринол, контрикал, сульфаніламідні препарати та інші) в якості лікарських засобів.

8. Використання ферментів при захворюваннях травної системи, при гнійно-некротичних процесах, як фібринолітичні препарати та інші.