Практична робота. Біологічна хімія належить до фундаментальних медичних дисциплін

Вступ

Біологічна хімія належить до фундаментальних медичних дисциплін. Знання біохімічних процесів, що відбуваються на різних рівнях організації – клітинному, органному, тканинному та цілому організмі – необхідні студентам-медикам як для розуміння метаболічних процесів обміну речовин, енергії, перебігу реакцій розпаду та синтезу, передачі спадкової інформації, процесів, що забезпечують перебіг фізіологічних функцій, так і для інтерпретації біохімічних показників з діагностичною або прогностичною метою у клініці.

Згідно програми з біологічної та біоорганічної хімії, що розроблена на засадах Європейської кредитно-трансферної системи (ECTS) для студентів вищих навчальних закладів освіти України ІІІ – IV рівнів акредитації, біологічна хімія включає чотири модулі. У кожен модуль входить певна кількість змістовних модулів і навчальних годин: на лекційний курс відведено 40 год.; практичні заняття – 120 год.; самостійну роботу студентів – 50 год., що відповідає 7 кредитам ECTS.

На кожному практичному занятті студенти мають засвоїти визначений програмою навчальний матеріал, провести дослідження різних речовин та інтерпретувати їх роль. До кожного змістовного модуля студентам пропонуються теми для індивідуальної самостійної роботи та тести.

Суттєва увага при вивченні біологічної хімії приділяється клінічним аспектам – спадковим та набутим порушенням обміну речовин, ензимопатіям, питанням застосування ензимів як фармпрепаратів, а також патохімічним процесам, які відбуваються при розвитку та перебігу цукрового діабету, атеросклерозу, ревматизму, інфаркту міокарда, захворювань травної системи тощо.

Для покращення засвоєння навчального матеріалу студенти мають використовувати сучасні підручники та посібники, що підготовлені провідними спеціалістами України та працівниками кафедри біохімії Львівського національного медичного університету.

Кінцеві цілі при вивченні навчальної дисципліни „Біологічна та біоорганічна хімія” пов’язані з тим, що студент у своїй майбутній професійній діяльності повинен вміти:

Ø Аналізувати відповідність структури біоорганічних сполук фізіологічним функціям, які вони виконують в організмі людини.

Ø Інтерпретувати особливості фізіологічного стану організму та розвитку патологічних процесів на основі лабораторних досліджень.

Ø Аналізувати реакційну здатність вуглеводів, ліпідів, амінокислот, що забезпечує їх функціональні властивості та метаболічні перетворення в організмі.

Ø Інтерпретувати особливості будови та перетворень в організмі біоорганічних сполук як основи їх фармакологічної дії в якості лікарських засобів.

Ø Інтерпретувати біохімічні механізми виникнення патологічних процесів в організмі людини та принципи їх корекції.

Ø Пояснювати основні механізми біохімічної дії та принципи спрямованого застосування різних класів фармакологічних засобів.

Ø Пояснювати біохімічні та молекулярні основи фізіологічних функцій клітин, органів і систем організму людини.

Ø Аналізувати функціонування ферментативних процесів, що відбуваються в мембранах і органелах для розуміння інтеграції обміну речовин.

Ø Класифікувати результати біохімічних досліджень та зміни біохімічних і ферментативних показників, що застосовуються для діагностики найпоширеніших хвороб людини.

Ø Інтерпретувати значення біохімічних процесів обміну речовин та його регуляції в забезпеченні функціонування органів, систем та цілісного організму людини.

Ø Підготовка методичних вказівок базується на засадах програми з навчальної дисципліни „Біологічна та біоорганічна хімія” (Київ, 2005) з врахуванням особливостей викладання на кафедрі біохімії ЛНМУ імені Данила Галицького.

З часу переходу викладання предмету “Біологічна та біоорганічна хімія” згідно вимог кредитно-трансферної системи (ECTS) минуло понад п’ять років. За цей період визначені певні позитивні та негативні аспекти викладання за цією системою. Враховуючи отриманий досвід колектив кафедри біохімії ЛНМУ імені Данила Галицького оновив методичні розробки з метою підвищення доступності та якості знань, що набувають студенти медичного факультету під час практичних занять.

Модуль 2. Загальні закономірності метаболізму

Тематичний план практичних занять з модуля 2

Завдання для самостійної роботи студентів (СРС)

При засвоєнні теми за традиційною системою студенту присвоюються бали: „5” – 15 балів, „4” – 12 балів, „3” – 9 балів, „2” – 0 балів.

Максимальна кількість балів за поточну навчальну діяльність студента – 120.

Студент допускається до підсумкового модульного контролю за умов виконання навчальної програми та у разі, якщо за поточну навчальну діяльність він набрав не менше 72 балів (9 × 8 = 72)

Підсумковий тестовий контроль зараховується студенту, якщо він демонструє володіння практичними навичками та набрав за тести і теоретичні питання не менше 50 балів.

ЗАГАЛЬНІ ПРАВИЛА ТЕХНІКИ БЕЗПЕКИ ПРИ РОБОТІ СТУДЕНТІВ У НАВЧАЛЬНІЙ ХІМІЧНІЙ ЛАБОРАТОРІЇ

1. Перебуваючи в хімічній лабораторії, необхідно суворо дотримуватись загальних правил техніки безпеки, пам’ятаючи, що будь - яке порушення може призвести до нещасного випадку.

2. У хімічній лабораторії працювати тільки в медичних халатах та шапочках. Довге волосся має бути акуратно підібране.

3. На робочому місці залишати тільки необхідні речі (книгу, зошити, ручки), всі інші речі (портфелі, сумки, одяг) зберігати в спеціально відведеному для цього місці, одяг у гардеробі.

4. Кожен студент повинен працювати за закріпленим за ним місцем, перехід на інше робоче місце без дозволу викладача не допускається.

5. Категорично забороняється виконувати в лабораторії роботи, не пов’язані із виконанням навчального практикуму.

6. Реактиви після їх використання необхідно ставити на відведене місце.

7. Роботи з концентрованими кислотами, лугами слід проводити обережно, під витяжною шафою, щоб виключити можливість їх потрапляння в очі, а також появи опіків і пошкодження одягу.

8. Бути обережним при роботі з електроприладами. Працювати тільки із заземленим обладнанням.

9. При запалюванні газу, кран пальника відкривати поступово.

10. Для уникнення нещасних випадків не працювати з леткими та легкозаймистими речовинами поблизу запаленого пальника.

11. Користуватись горючими і токсичними речовинами (галогени, концентровані кислоти, луги, сірководень і т.д.), а також проводити досліди, які супроводжуються виділенням шкідливих парів, газів, дозволяється тільки у витяжній шафі.

12. При нагріванні речовин у пробірці - не направляти її отвір у бік товариша, який працює, або до себе.

13. Не можна залишати в лабораторії без нагляду включені фотоелектроколориметри, водяні бані, газові пальники, центрифуги тощо.

14. У випадку пожежі негайно погасити найближчі пальники і гасити вогонь використовуючи вогнегасник, покривало, пісок.

15. При опіках: а) сильними лугами – необхідно промити уражені ділянки тіла водою і накласти компрес, змочений 1% розчином оцтової кислоти; б) сильними кислотами – необхідно промити уражені ділянки тіла водою і накласти компрес, змочений 1% розчином соди; в) фенолом – необхідно розтерти побілілу від опіку ділянку до нормального стану шкіри, а потім промити водою і накласти пов’язку з гліцерином.

16. У разі потрапляння кислоти або лугу в очі необхідно промити їх великою кількістю води, а потім 2% розчином соди або борної кислоти.

17. Не виливати в раковину вміст пробірок з концентрованими кислотами та лугами.

18. Не кидати папір, сірники, побитий посуд в водостічну раковину, для цього користуватись ящиками для сміття.

19. Після закінчення роботи привести в порядок своє робоче місце, протерти полиці і стіл вологою ганчіркою, поставити посуд з реактивами на відведене місце виключити воду та газ.

20. Під час заняття мобільні телефони повинні бути виключеними.

Модуль 2. Загальні закономірності метаболізму.

Змістовий модуль № 5. Вступ у біохімію. Біохімічні компоненти клітин.

Тема № 1. Предмет і завдання біохімії. Мета і методи проведення біохімічних досліджень; їх обґрунтування і клініко-діагностичне значення.

Мета заняття: Ознайомити студентів з предметом і завданнями біологічної хімії та її практичним використанням, методами біологічних досліджень, які використовуються в клінічній практиці.

Оволодіти деякими фізико-хімічними методами досліджень біологічно важливих речовин, а також ознайомитися з апаратурою, що використовується в біохімії. Отримання результатів біохімічних досліджень необхідно для пояснення механізмів функціонування органів і тканин у нормі та при патології, для постановки діагнозу, моніторингу перебігу захворювання та ефективності лікування. Знати фактори, дія яких призводить до похибки біохімічних досліджень.

Актуальність теми: Біохімія – це наука, яка вивчає хімічний склад живих організмів, будову, властивості, локалізацію та роль наявних у них сполук, шляхи їх виникнення і перетворення, а також притаманні живій клітині хімічні процеси, які в сукупності забезпечують обмін речовин й перетворення енергії.

Через біохімію лежить шлях до розв’язання основних питань природознавства і медицини, зокрема, проблеми синтезу білків, довголіття.

У біохімічних дослідженнях використовуються сучасні фізико-хімічні, фізичні та математичні методи. Біохімічні показники використовуються для діагностики, лікування та профілактики захворювань.

Конкретні завдання:

1. Знати етапи та закономірності становлення біохімії як фундаментальної медико-біологічної науки та навчальної дисципліни;

2. Знати принципи методів біохімічних досліджень функціонального стану організму людини в нормі та при патології;

3. Використовувати результати біохімічного аналізу для оцінки стану певних ланок обміну речовин;

4. Вміти визначати оптичну густину забарвлених розчинів при різних довжинах хвиль на фотоелектроколориметрі. Правильно інтерпретувати отримані результати.

Теоретичні питання

1. Предмет і завдання біохімії. Основні напрямки та розділи біохімії: статична, динамічна, функціональна біохімія, медична та клінічна біохімія.

2. Біохімія як фундаментальна медико-біологічна наука. Історія розвитку, наукові біохімічні школи, значення в системі вищої медичної освіти.

3. Внесок вчених кафедри біохімії Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького в розвиток біологічної хімії.

4. Хімічний склад живого організму. Біомолекули (білки, вуглеводи, ліпіди, нуклеїнові кислоти, гормони, вітаміни тощо), їх біохімічні функції. Характерні риси живої матерії: обмін речовин й енергії та їх зв’язок із зовнішнім середовищем.

5. Структурні елементи прокаріотичних та еукаріотичних клітин. Основні функції субклітинних органел, їх фракційне розділення методом ультрацентрифугування.

6. Принципи основних методів біохімічних досліджень:

• осадження речовин з розчину, висолювання білків;
• оптичні методи в біохімії (фотоелектроколориметрія, спектрометрія, спектрофотометрія, флюоресцентний аналіз);
• електрофорез (горизонтальний, диск-електрофорез, ізоелектричне фокусування, імуноелектрофорез);
• хроматографія (афінна, іонообмінна, тонкошарова, газова, гель-хроматографія);
• полярографія;
• манометричний та радіоізотопний методи;
• імуноферментні методи;
• полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР)

7. Мета проведення біохімічних лабораторних досліджень і критерії оцінки використаних методів лабораторних досліджень.

8. Матеріал для лабораторних діагностичних досліджень, принципи забору та збереження матеріалу для лабораторних досліджень.

9. Характеристика помилок, що мають місце під час проведення лабораторних досліджень.

Наукові напрями роботи кафедри біохімії

Кафедра біохімії заснована у 1894 р. при медичному факультеті Львівського Університету професором Владиславом Нєміловичем (1863-1904), який у 1891 році на запрошення Львівського університету приїхав з Відня працювати доцентом з фармакогнозії і одночасно читав лекції з хімії. З 1906 по 1919 рр. кафедрою завідував професор Станіслав Людвіг Філіп Бондзінський (1862-1929), який розгорнув велику педагогічну і наукову діяльність. Темою наукової роботи кафедри були так звані оксипротеїнові кислоти – продукти білкового характеру, які в невеликій кількості виділяються з сечею, а також дослідження жовчних пігментів і продуктів їх обміну.

З 1922 року кафедрою завідував професор Яків Парнас (1884-1949). Під його керівництвом було вивчено ряд актуальних питань біохімії, а саме, особливості метаболізму глікогену, взаємозв'язок процесів гліколізу і спиртового бродіння, зв'язки між реакціями гліколізу та іншими ферментативними перетвореннями в м'язах. Були досліджені процеси анаеробного обміну вуглеводів, який у сучасній біохімічній літературі названо теорією Ембдена-Мейєргофа-Парнаса. Під його керівництвом кафедра активно включилась у вивчення процесів обміну аденілової кислоти в м’язах та її роль в утворенні аміаку, проводились дослідження обміну похідних пурину та особливостей їх метаболізму при діабеті, особливостей метаболізму стереоізомерних молочних кислот в організмі та інше. Я. Парнас вперше у світі застосував радіоактивні ізотопи в біохімічних дослідженнях. На кафедрі були створені біохімічна лабораторія і бібліотека. „Школа професора Парнаса” стала всесвітньо відомою, а Львівський інститут медичної хімії займав одне з перших місць серед ведучих світових центрів біохімії.

У 1944 році завідувачем кафедри став професор Богдан Собчук (1909-1974). Основні напрямки наукової роботи кафедри під його керівництвом – обмін вуглеводів у злоякісних пухлинах та дія оксиду вуглецю (II) на гемові білки, а також вивчення біохімічних процесів при різних патологіях організму людини.

З 1974 року кафедрою керував професор Михайло Шлемкевич (1928-1998). Під його керівництвом на кафедрі біохімії у тісній співпраці з кафедрою онкології вивчали індивідуальну чутливість ракових пухлин шлунка людини при застосуванні хіміотерапії; досліджували механізми розвитку їх резистентності при цьому; вивчали особливості нуклеїнового і вуглеводного обмінів у злоякісних клітинах. У дослідженнях були використані фармацевтичні препарати, мічені радіоактивними ізотопами. На кафедрі проводились також експерименти з метою вивчення змін у вуглеводному та нуклеїновому обмінах при отруєнні чадним газом, були запропоновані нові методи вивчення монооксиду вуглецю в повітрі, карбоксигемоглобіну в крові.

З 1995 року кафедру очолив професор Михайло Тимочко (1935-1998). Основними напрямами робіт, що здійснювались під його керівництвом, були вивчення впливу шкідливих екологічних факторів на функції органів травної системи, дослідження ролі енергетичного обміну в патогенезі хронічних захворювань печінки, серцево-судинної системи, визначення ступеня ризику в абдомінальній та ендокринній хірургії, визначення рівня інтоксикації у онкологічних хворих, вивчення процесів пероксидації ліпідів та стану антиоксидантної системи в експерименті та клініці.

З 1998 року кафедрою завідує професор Олександр Скляров. На кафедрі проводяться дослідження по вивченню впливу стресу на цитопротективні та ульцерогенні механізми слизової оболонки органів травної системи, метаболічні та іонно-транспортні процеси, вплив екзоекологічних факторів на ендоекологічний стан внутрішнього середовища, дослідження ролі прозапальних систем організму (ЦОГ-2/ПГ, 5-ЛОГ/ЛТ, іNOS/NO) у патогенезі захворювань травного тракту (виразкова хвороба шлунка, ульцерогенний коліт, гострий панкреатит, тощо) та їх взаємозв’язок із процесами ліпопероксидації у клітинах. Окремим напрямом досліджень є вивчення молекулярних механізмів розвитку метаболічних змін у травній системі за умов експериментального діабету та пошук шляхів їх корекції. На кафедрі продовжується вивчення впливу антиоксидантних вітамінів аскорбінової кислоти, токоферолу та коротко ланцюгових пептидів, зокрема мет- і лей-енкефалінів та тимогексину на процесм цитопротекції та ульцерогенезу у слизовій оболонці шлунка та товстої кишки.

Характеристика фізико-хімічних методів дослідження

У біохімії широкого застосування набули діаліз, центрифугування, оптичні та електрохімічні методи, різні види хроматографії, радіоімунні дослідження тощо.

Центрифугування. Суть процесу центрифугування полягає в розділенні неоднорідних систем (суспензій, емульсій) у полі дії доцентрових сил. Під дією цих сил суспензії розділяються на тверду фазу – осад і рідку – центрифугат, який називають також супернатантом, або надосадовою рідиною. Значну роздільну здатність має так зване центрифугування в градієнті густини. У цьому разі частинки речовини в процесі центрифугування розділяються вздовж градієнта у вигляді дискретних зон або полюсів.

Залежно від фактора розділення (характеризує відношення прискорення доцентрових сил до прискорення сили тяжіння) центрифуги умовно поділяють на звичайні (G – до 3500) і ультрацентрифуги (G – понад 3500, відцентрове прискорення G = ώ ²·R, де ώ – кутова швидкість (рад/сек.); R – радіус ротора (см)). Звичайні центрифуги використовують з метою препаративного центрифугування. Ультрацентрифуги дають змогу розвинути доцентрове прискорення поля до 300 000 G. Вони використовуються з аналітичною метою, для визначення молекулярної маси речовин та виділення їх окремих фракцій з розчинів.

До оптичних методів дослідження належать: фотоелектроколориметричні, спектрофотометричні, флюоресцентний та ін.

Серед сучасних методів дослідження перевагу віддають спектральному аналізу. Він належить до фізико-хімічних методів якісного й кількісного визначення атомного та молекулярного складу речовин. Ці методи грунтуються на дослідженні спектрів, що поглинаються або випромінюються аналізованими речовинами. В основу цих методів покладено принцип вимірювання зміни інтенсивності світлового потоку. Залежно від довжини хвилі змінюється характер випромінювання, тому електромагнітний спектр поділено на зони: g– і космічні промені з довжиною хвилі 0, 1 – 9 нм, ультрафіолетова зона – 100 – 380 нм, видима зона – 380 – 760 нм, інфрачервона зона – 760 – 1100 нм.

Серед спектральних методів дослідження виділяють абсорбційні та імерсійні. Абсорбційна спектроскопія полягає у вимірюванні поглинання світла, що проходить крізь досліджуваний розчин унаслідок абсорбції його речовиною, яку визначають. Кожна речовина поглинає світло певної довжини хвилі, отже, абсорбція світла вибіркова.

Фотометричні методиоптичного фізико-хімічного аналізу поділяють на дві групи: абсорбційну та емісійну фотометрію.

Абсорбційна фотометрія – це метод, що грунтується на встановленні ступеня послаблення монохроматичного світлового потоку внаслідок вибіркового поглинання світла розчиненою речовиною. Основним законом фотометрії є закон Ламберта – Бера, що формулюється таким чином: логарифм відношення інтенсивності світлового потоку, що проходить через розчин до інтенсивності світлового потоку, що виходить з розчину, прямо пропорційний концентрації речовини і товщині поглинального шару.

До методів абсорбційної фотометрії належать спектрофотометрія і нефелометрія.

Спектрофотометрія, або в ширшому розумінні колориметрія – це визначення інтенсивності забарвлення розчину досліджуваної речовини відносно інтенсивності забарвлення еталонного розчину з точно відомою концентрацією.

Фотоколориметрія – це вимірювання поглинання видимої частини спектра забарвленими розчинами.

Власне спектрофотометрія – це вимірювання поглинання (і пропускання) прозорих розчинів в ультрафіолетовій, видимій та інфрачервоній зонах спектра (220 – 1100 нм).

Прилади, якими вимірюють світлопоглинання речовин, називаються абсорціометрами. До них належать фотоелектроколориметри і спектрофотометри. Фотоелектроколориметри дають змогу проводити вимірювання у видимій частині спектра. За допомогою спектрофотометрів проводять вимірювання в широкому діапазоні хвиль від ультрафіолетового до інфрачервоного (210 – 1100 нм) і досліджують забарвлені та безбарвні розчини у вузькій частині спектра, в зоні максимального поглинання монохроматичного потоку світла.

В основі абсорбційної спектроскопії – загальні принципи здатності речовин поглинати світлову енергію за законом Ламберта – Бера. Під час вимірювання інтенсивності поглинання світлового потоку користуються величиною, яка називається оптичною густиною розчину й позначається буквою А:

А = k · С · d, де С – концентрація (моль/л), d – товщина шару (см), k – молярний коефіцієнт поглинання (екстинкція). Цей коефіцієнт поглинання відповідає оптичній густині 1 М розчину за товщини шару в 1 см.

Нефелометрія –це метод аналізу, пов’язаний з оцінкою ступеня мутності досліджуваного розчину. Інтенсивність розсіювання залежить від розмірів частинок і кількості розчиненої речовини.

Емісійна фотометрія – грунтується на визначенні енергії, яка випромінюється досліджуваною речовиною в енергетично збудженому стані. До методів емісійної фотометрії відносять флюориметрію і полум’яну фотометрію.

Флюориметрія базується на ефекті флюоресценції, що дає енергетично збуджена досліджувана речовина під впливом короткохвильового опромінення.

Полум’янафотометрія полягає у використанні як енергетичного агента, що забезпечує стан збудження розчину досліджуваної речовини, полум’я газової горілки. Йони металів забарвлюють полум’я відповідно до характерних для них спектрів випромінювання. Щоб виділити випромінювання окремих йонів, застосовують спеціальні світлофільтри, після чого виконують всі необхідні вимірювання.

Явище холодного світіння деяких речовин, спричинене зміною електронного стану молекул або атомів, називається люмінесценцією.

Люмінесцентний аналіз, в основі якого лежить флюоресценція, набув широкого застосування. Вимірювання інтенсивності флюоресценції залежить від концентрації речовин, що дає змогу проводити кількісне визначення речовин на спеціальних приладах – флюориметрах. У ході цих досліджень як джерело збудження використовують ультрафіолетове випромінювання.

Електрофорез – розділення заряджених частинок в електричному полі. Різна молекулярна маса зарядів речовин визначає різну швидкість пересування, що дає змогу їх диференціювати. Швидкість руху йонів збільшується з посиленням електрофоретичного заряду, сили електричного поля, але зменшується зі збільшенням радіуса частинок, що рухаються, і збільшенням в’язкості середовища. На швидкість руху заряджених частинок впливає температура навколишнього середовища, з підвищенням якої наростає швидкість руху йонів.

Використовують такі методи електрофорезу: фронтальний, зональний, ізоелектричне фокусування, імуноелектрофорез.

Фронтальний електрофорез – розділення речовин у гомогенному розчині без стабілізації зон розподілу. Зональні методи електрофорезу дають змогу отримувати стабільні зони розподілу й класифікуються залежно від роздільного середовища. Для цього типу електрофорезу як середовище використовують порошки та інші пористі матеріали (крохмаль, целюлоза, полівінілхлорид), гелі (крохмальний, агаровий, поліакриламідний), смуги паперу та інших волокнистих матеріалів.

Зональний електрофорез залежно від джерела живлення і камери поділяється на горизонтальний і вертикальний (диск-електрофорез).

Імуноелектрофорез належить до найчутливіших і найсучасніших методів імунологічного аналізу. За допомогою цього методу можна визначити кількість компонентів суміші, а також ідентифікувати ці компоненти за їхньою електрофоретичною рухливістю, імунологічною специфічністю, а іноді – за хімічною природою, а також виявити речовини, здатні давати реакцію преципітації з антитілами, тобто переважно білки і вуглеводи.

Метод імуноелектрофорезу дає змогу дуже точно встановити компоненти складних білкових сумішей за їх імунологічною специфічністю та електрофоретичною рухливістю.

Хроматографія.

Для розділення й кількісного визначення білків і амінокислот, нуклеїнових кислот, вуглеводів, ліпідів та інших метаболітів використовують різні методи хроматографії.

Існує декілька різновидів хроматографічного методу аналізу. Найважливіші з них:

· адсорбційна хроматографія, що базується на різній здатності окремих сполук адсорбуватися на тих чи тих сорбентах;

· йонообмінна, що базується на різній здатності розділюваних речовин до йонного обміну з тим чи тим іонітом;

· розподільна, що грунтується на різній розчинності розділюваних речовин, у двох рідинах, що частково змішуються;

· дифузна, що грунтується на розділенні речовин за швидкістю дифузії всередину сорбента (гель-фільтраційна хроматографія, при якій розділення речовин грунтується на механічному явищі молекулярного просіювання);

· хроматографія за спорідненістю (афінна хроматографія) – високоспецифічний метод розділення різних сполук, що базується на використанні нерозчинних форм біологічно активних речовин, споріднених з розділюваними речовинами.

У ході газової хроматографії розділення суміші речовин здійснюють в атмосфері газу. Адсорбційну, йонообмінну, розподільну, дифузну хроматографію можна проводити в колонках і на площині (на папері і в тонких шарах).

Гель-фільтрація дає змогу розділяти речовини залежно від їх молекулярної маси й форми молекул. Цей метод базується на здатності молекул різних розмірів і форм дифундувати в гелі з різною швидкістю. Для гель-фільтрації найчастіше застосовують декстранові гелі, які отримали назву сефадексів.

Полярографічний метод грунтується на принципі визначення сили струму під час окисно-відновних реакцій на зовнішній поверхні робочого електроду. На момент проходження струму в процесі електровідновлення або електроокиснення на полярограмах з’являються ділянки з силою струму пропорційною концентрації реагентів. Зміна висоти полярограм дає уявлення про концентрацію речовини.

Завдяки дослідженню біологічних об’єктів полярографічним методом виявляють катіони, аніони, амінокислоти, вітаміни, вуглеводи та інші речовини.

Особливе місце займає полярографічний метод у дослідженні білків і ферментів: дає відомості про деякі функціональні групи білків (-SH, -NH₂, імідазольну групу), каталітичну активність ферментів тощо.

Використання манометричного і радіоізотопного методів дає змогу провести дослідження як на рівні клітини, так і на рівні цілого організму.

Імуноферментний аналіз (ІФА) – метод кількісного визначення речовин з дуже низькою концентрацією, що спричинюють утворення антитіл. Основою цього методу є реакція “ антиген – антитіло”, тобто, специфічне зв’язування антитіла з певною речовиною.

Для кількісного аналізу застосовують переважно два види ІФА. Першим етапом здійснення аналізу виступає зв’язування моноспецифічних антитіл на поверхні твердої фази. Далі реалізується реакція конкурентного або непрямого типу. Антиген, мічений ферментом, конкурує з неміченим досліджуваним антигеном за антитіла на твердій фазі. В іншому варіанті біологічні рідини реагують з іммобілізованими на твердій фазі антитілами, після чого решту суміші видаляють і в реакцію вводять мічені ферментом антитіла, які зв’язуються вже іммобілізованим антигеном.

Зразки сироватки крові, що містять досліджувану речовину поміщають у лунки планшету для мікротитрування із сорбованими на стінках антитілами, здатними специфічно зв’язувати цю речовину, наприклад гормон. Одночасно до інкубаційної суміші додають невелику кількість гормону, хімічно зв’язаного з ферментом, так званий кон’югат. Кон’югат і гормон, який визначають, конкурують між собою за зв’язування з обмеженою кількістю сорбованих антитіл. Після реалізації зв’язування антигенів незв’язані молекули відмивають.

Для встановлення кількості зв’язаного кон’югованого антигену в лунки вносять субстратний буфер і пофарбовані продукти ферментативної реакції виявляють фотометрично. Чим більше гормону в тестованій пробі, тим менше кон’югату буде зв’язуватися з антитілами. Кількісна оцінка здійснюється з урахуванням калібрувальної кривої, побудованої за стандартними зразками з відомою концентрацією.

Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) – це високоспецифічний метод експрес–діагностики, що дозволяє множити певні нуклеотидні послідовності до утворення необмеженого числа копій генів в таких кількостях, які можна виявити методом молекулярної гібридизації за допомогою електрофорезу. ПЛР базується на багатократному повторюванні циклів синтезу (ампліфікації) специфічної ділянки ДНК–мішені з дезоксинуклеозидтрифосфатів у присутності термостабільної ДНК–полімерази, відповідного сольового буфера та олігонуклеотидних затравок–праймерів, що визначають кордони ампліфікованої ділянки ДНК-мішені. Для діагностики інфекційного захворювання підбираються системи праймерів, комплементарних специфічним для збудника ділянкам генів, які дозволяють ампліфікувати фрагмент, що має для кожної системи праймерів свою довжину.

Загальні принципи клініко-біохімічної оцінки результатів досліджень

До способів розрахунку результатів дослідження, які використовують у клінічній біохімії, можна віднести застосування умовних одиниць, розрахунки за стандартним (еталонним розчином), калібрувальним графіком, коефіцієнтом перерахунку.

Умовні одиницівикористовуються поряд із системними одиницями переважно в традиційних методиках.

Стандартні розчини обробляють одночасно із серією досліджуваного біоматеріалу і перебувають у тих самих умовах, що й останній. Еталонні розчини повинні містити суворо визначену концентрацію певної речовини. Результати дослідження розраховують за способом пропорції: за трьома відомими величинами встановлюється четверта, досліджувана:

А_ст С_ст

^______ = ^______ ,

А_дос С_х

де А_ст – екстинкція стандартного розчину; А_дос – екстинкція досліджуваної проби; С_ст – відома концентрація стандартного розчину; С_х – досліджувана концентрація проби.

Калібрувальні графіки будують для кожного фотометра, використовуючи серію стандартних розчинів. Такі розчини різняться за концентрацією речовини, бажано в порядку наростання.

Розрахунок за допомогою коефіцієнта перерахунку найпростіший. Розрахунки виконують за формулою:

С = F·А,

де С – концентрація досліджуваного компонента;

F – коефіцієнт перерахунку; А – екстинкція досліджуваної реакційної суміші.

Коефіцієнт перерахунку – величина специфічна для кожного окремого тесту.

Помилки, що трапляються під час проведення лабораторних досліджень

У ході лабораторного дослідження можна припуститися помилок. До складу остаточного результату кожного визначення входять остаточно дійсна вартість (дійсні величини) та певні помилки. Оцінка достовірності результату та його клінічна оцінка потребують знання видів помилок. Загалом під час діагностичних досліджень трапляються помилки, які можна класифікувати так: 1) помилка перед проведенням дослідження; 2) аналітична лабораторна помилка; 3) інтерпретаційна помилка.

Помилка перед проведенням дослідження охоплює групу факторів, які можуть впливати на остаточний результат досліджень, доки матеріал аналізують у лабораторії. Ці фактори пов’язані з підготовкою хворого до дослідження, із забором та зберіганням матеріалу до початку аналізу.

Вплив уживаних ліків завжди треба брати до уваги під час інтерпретації результату. Вирішуючи питання впливу лікарських засобів на результат дослідження, необхідно передусім з’ясувати існування двох основних механізмів інтерференції.

Перший механізм полягає в інтерференції ліків або їх продуктів з ідентифікаторами або методами визначення. Насамперед, це фізико-хімічний та біохімічний вплив. Прикладами фізико-хімічної взаємодії є можливість зміни відносної густини сечі за умови застосування більшої кількості декстрану або вплив тетрацикліну на визначення концентрації глюкози. Прикладом біохімічного впливу може бути вплив лікарських засобів з відновними властивостями на завищені результати визначення вмісту креатиніну.

Ці впливи, тобто фізико-хімічна та біохімічна інтерференція, спричинені переважно дефіцитом специфічних методик.

Другий механізм базується на фармакологічній дії препаратів, незалежно від запланованого лікування, на складові або процеси системи, які призводять до змін, не пов’язаних із захворюванням.

Інтерференція, спричинена фармакологічною дією ліків, має дуже важливе значення. Її не можна залишати поза увагою. Істотне значення має також кількість медикаментів та індивідуальна чутливість організму, а також спосіб їх застосування.

Виключення помилки, пов’язаної з впливом ліків, вимагає проведення досліджень перед лікуванням або в процесі лікування з вибором найкращого методу забору матеріалу. Вважають, що інтерференція лікарських засобів буде найменш вираженою за найнижчої їх концентрації в організмі.

Незалежно від того чи відбувається обмеження впливу ліків, цей фактор треба взяти до уваги під час інтерпретації результату, а саме непередбачуваного результату.

Аналітична (лабораторна) помилка. Ця помилка пов’язана з ходом дослідження біологічного матеріалу в лабораторії. Систематична помилка (точності ) відтворює різницю між величиною отриманою і дійсною. Джерелом систематичної помилки виступають властивості методу або способи його реалізації, які є причиною того, що визначений показник не відповідає дійсній величині, тобто, вона зумовлена особливостями методу або лабораторією (дослідником).

Прикладом систематичної помилки методу може бути визначення концентрації глюкози за методом Гагедорна-Єнсена, що ґрунтується на відновних властивостях глюкози. Інші наявні в крові речовини з відновними властивостями також беруть участь у реакції. Тому результат визначення рівня глюкози цим методом завищений.

Систематична помилка в лабораторії полягає в тому, що в процесі дослідження виявляють неточність, яка постійно повторюється. Вона може стосуватися кожного етапу процесу (продукування ідентифікаторів, приготування та визначення стандарту) або може бути пов’язана з лабораторним устаткуванням.

Випадкова помилка (повторюваності) забезпечується різницею між результатами вимірювання одного й того ж самого зразка на тому самому лабораторному устаткуванні й тим самим методом, спричиненою змінами умов під час виконання вимірів. Джерело випадкової помилки пов’язане зі взаємодією багатьох непередбачуваних факторів і тих випадків, які змінюють умови визначення. Саме ця зміна зумовлює різницю результатів кількох визначень одного й того ж самого зразка в тому самому матеріалі.

Мірою випадкової помилки є акуратність (точність). Найчастіше її відхилення приймають за стандарт або визначають у відсотках як коефіцієнт зміни.

Під час аналітичного процесу, який охоплює багато дій і методів та значну кількість визначень, може порушитися перебіг одного з етапів процесу або однієї з дій. Це формує помилку, що називається тривіальною.

Частота помилок важлива під час обчислення показника. Вважається, що одна помилка на 2000 значень становить абсолютний мінімум.

Помилка інтерпретації результату. Використання поодинокого результату лабораторного аналізу в діагностичному процесі або моніто­ринг під час терапії можуть бути джерелом численних і зумовлених різ­ними факторами помилок.

Помилка І типу: на основі результату дослідження роблять висновки про наявність патології, у насправді дійсно здорового хворого.

Помилка II типу: на основі результату дослідження дійсно хворого вважають здоровим. Ці два типи помилок мають місце за граничних значень.

Щоб уникнути таких помилок або зменшити їх кількість, треба пам’ятати, що є фізіологічні коливання (інколи вони є значущими) інтерферують із можливістю клінічної інтерпретації отриманого результату. Це наводить на думку про необхідність проведення додаткових до­сліджень. Такі зміни можуть бути циклічними – годинними, денними, сезонними. Крім того, слід враховувати, що зміна внутрішнього середовища організму пов’язана з багатьма досліджуваними параметрами.

Кожний етап процесу від моменту початку дослідження до моменту отримання і використання результату може бути джерелом помилки. Встановлення причин помилок допомагає обмежувати їх до мінімуму.

Практична робота

Визначення оптичної густини забарвлених розчинів у залежності від їх концентрації.

Кожна речовина має свій спектр поглинання з максимумом при певній довжині хвилі. Тому концентрації розчинів різних речовин вимірюють при довжині хвилі, що відповідає максимуму поглинання.

Дослід 1.Виміряти оптичну густину (А) розчину, що містить різну кількість фосфору.

Принцип методу. Фосфати в розчині сульфатної кислоти утворюють з молібдатами фосфорно-молібденові комплекси, які відновлюються до молібденової сині. Кількість фосфатів визначають колориметрично (за інтенсивністю забарвлення) за реакцією утворення комплексної фосфорно-молібденової кислоти та її відновлення до молібденової синьки.

Матеріальне забезпечення: стандартний розчин фосфору 0, 32 мM, молібденовий реактив, пробірки, піпетки, фотоелектроколориметр (ФЕК).

Хід роботи: У п’ять пробірок додають розчини у кількостях, наведених нижче в таблиці:

Розчини змішують і не раніше, ніж через 2 хв, але не пізніше, ніж через 5 хв, вимірюють величину оптичної густини на ФЕКу, використовуючи червоний світлофільтр. За результатами вимірювань будують графік залежності оптичної густини від концентрації фосфору в мкмоль/мл.

Зробити висновок. Пояснити вплив концентрацій речовин на величину оптичної густини.

Дослід 2. Визначення наявності білків у розчині методом осадження сульфосаліциловою кислотою.

Принцип методу. Білки легко осаджуються із водного розчину мінеральними, органічними кислотами та солями важких металів. Денатурація і осадження білка кислотами обумовлюється нейтралізацією поверхневого заряду колоїдних частинок білка, руйнуванням гідратаційної оболонки білкових молекул та утворенням комплексних солей білка з кислотами. Важкі метали утворюють стійкі комплекси з SH-групами білків, що викликає зміни структури та втрату розчинності білка. Особливо чутливою реакцією на наявність білка в розчині є осадження трихлорацетатною та сульфосаліциловою кислотою (чутливість останньої реакції складає 1: 50000). Крім того, сульфосаліцилова кислота здатна осаджувати поряд з високомолекулярними білками, низькомолекулярні білки та продукти розпаду білків – поліпептиди і олігопептиди.

Матеріальне забезпечення: пробірки, розчин білка, 20 %-ний розчин сульфосаліцилової кислоти.

Хід роботи: У пробірку наливають 1, 0 мл досліджуваного розчину білка та додають 3 – 5 крапель 20 %-го розчину сульфосаліцилової кислоти. Спостерігають за утворенням осаду білка.

Клініко-діагностичне значення. Реакція з сульфосаліциловою та трихлорацетатною кислотами використовується для якісного та кількісного визначення білка в сечі.

Здатність білка міцно зв’язувати іони важких металів використовується в клінічній практиці. Білок використовують як протиотруту при отруєннях солями ртуті, свинцю тощо. У разі отруєння солями важких металів хворому дають велику кількість білка (яєчного білка або молока). В шлунку утворюються нерозчинні комплекси металів з білками, внаслідок чого припиняється всмоктування отрути в кров, послаблюється інтоксикація та посилюється їх виведення з організму.

Дослід 3. Кількісне визначення білка в досліджуваному розчині шляхом вимірювання оптичної густини колориметричним методом (Біуретова реакція).

Принцип методу. Біуретова реакція – характерна реакція на сполуки, що містять в своєму складі не менше двох пептидних зв’язків. Такі сполуки в лужному середовищі утворюють з купруму сульфатом (мідним купоросом) комплекс, забарвлений у рожево-фіолетовий колір. В утворенні цього комплексу беруть участь пептидні зв’язки в енольній формі. Біуретова реакція служить доказом наявності пептидних зв’язків у білках та пептидах.

Матеріальне забезпечення: сироватка крові, калій-натрій виннокислий, міді сульфат, 0, 9 % розчин NаCl, 10 % розчин NaOH, мірні пробірки, піпетки на 1, 2 і 10 мл, ФЕК, біуретовий реактив: 0, 15 г CuSO₄ · 5 Н₂О; 0, 6 г калію-натрію виннокислого і 50 мл Н₂О. Суміш перемішують і додають 30 мл 10 % розчину NаОН, 0, 1 г калію йодиду і доводять водою до об’єму 100 мл (зберігають у холодильнику в запарафінованому посуді).

Хід роботи: У першу пробірку вносять 0, 1 мл 0, 9 % розчину NаCl (контроль), у другу – 0, 1 мл стандартного розчину білка (50 г/л), у третю, четверту і п’яту пробірки – по 0, 1 мл досліджуваного розчину білка (задачі). У кожну пробірку додають по 5 мл біуретового реактиву, перемішують і через 30 хв визначають екстинкцію за допомогою фотоелектроколориметра в кюветах товщиною 10 мм при синьому світлофільтрі (440 нм) проти контрольного розчину. Поява фіолетового забарвлення (біуретова реакція) свідчить про наявність у розчині білка чи поліпептидів. Інтенсивність забарвлення змінюється залежно від концентрації білка в розчині.

Розрахунок проводять за формулою:

Х= (С ´ А_і) / А_ст, де:

Х – концентрація речовин у дослідній пробі, г/л;

С – концентрація речовин у стандартному розчині;

А_і – оптична густина досліджуваного розчину;

А_ст – оптична густина стандартного розчину білка.

Пояснити отриманий результат. Зробити висновок. Вказати на властивості білків утворювати в лужному середовищі з CuSO₄ комплекс рожево-фіолетового забарвлення.

Кількісно загальний білок можна визначати в сироватці або плазмі крові за допомогою тестового набору реактивів напівавтоматичним біохімічним аналізатором „Stat Faх 1904 plus”.

Клініко-діагностичне значення. Для кількісного визначення білків у біологічному матеріалі найчастіше застосовують фотоколориметричні та спектрофотометричні методи, у деяких випадках застосовують фотонефелометричні методи, а також визначення білка за вмістом загального нітрогену (азотометрія).

У клініко-біохімічних лабораторіях для встановлення діагнозу захворювання проводять визначення концентрації білків у біологічних рідинах організму (крові, сечі, спинномозковій рідині, ексудатах). У нормі вміст загального білка у сироватці крові дорівнює у дорослих 65-85 г/л (6, 5-8, 5 г %), у дітей до 6 років 56-85 г/л (5, 6-8, 5 г %).

Колориметричні методи визначення кількості білка базуються на „кольорових” реакціях на функціональні групи білків: біуретова реакція; мікрометод визначення кількості білка за допомогою реактива Бенедикта; метод Лоурі; метод Лоурі в модифікації Святкіна (метод використовують для визначення вмісту білка в препаратах з підвищеним вмістом ліпо- і глікопротеїнів); метод Флореса.

Ультраспектрофотометричний метод визначення кількості білка базується на здатності ароматичних радикалів тирозину, триптофану і меншою мірою – фенілаланіну білка поглинати ультрафіолетове світло з максимумом поглинання при 280 нм.

Визначення вмісту білка сироватки крові рефрактометричним методом, основаним на неоднаковій здатності різних середовищ заломлювати промінь світла, що проходить через них. Відношення синуса кута падіння світла до синуса кута заломлення є постійною величиною і називається показником заломлення. Величина показника заломлення сироватки крові залежить, головним чином, від вмісту в ній білка. Для визначення показника заломлення використовують спеціальні прилади – рефрактометри.

Контроль виконання лабораторної роботи

1. Назвати оптичні методи дослідження, які використовуються в клінічній біохімії:

А. Фотоелектроколориметричні

В. Афінна хроматографія

С. Флюоресцентний аналіз

D. Полярографія

Е. Імуноферментний аналіз

2. Для виявлення функціональних груп (-SH, -NH₂, імідазольних) у білках, ферментах використовують такі методи дослідження:

А. Електрофорез

В. Люмінесцентний аналіз

С. Іонообмінну хроматографію

D. Полярографію

Е. Імуноферментний аналіз

3. Вказати метод, який найбільш доцільно використати для фракціонування білків:

А. Люмінесцентний аналіз

В. Електрофорез

С. Іонообмінну хроматографію

D. Полярографію

Е. Імуноферментний аналіз

4. З біологічної рідини шляхом висолювання виділили білок, який буде використаний для лікування. Яким методом можна звільнити його від низькомолекулярних домішок?

А. Секвенацією

В. Денатурацією

С. Висолюванням

D. Електрофорезом

Е. Діалізом

5. У сироватці крові хворого на пієлонефрит виявлено зміни у співвідношенні білкових фракцій. Вкажіть, яким методом можна розділити на фракції білки плазми крові?

Приклади тестів „Крок-1”

1. Для кількісного розділення і визначення відносного вмісту кожної амінокислоти в гідролізаті білків використовують:

А. Електрофорез

В. Розподільну хроматографію

С. Іонообмінну хроматографію

D. Ультрацентрифугування

Е. Гель-фільтрацію

2. Лікар призначив пацієнту аналіз білкових фракцій крові. В лабораторії був використаний метод електрофорезу. Яка властивість білків дає змогу застосовувати даний метод?

А. Здатність до набухання

В. Оптична активність

С. Високий онкотичний тиск

D. Наявність електричного заряду

Е. Висока в’язкість

3. В клініку доставлено хворого у важкому стані після отруєння солями плюмбуму. Яка з перелічених речовин може застосовуватися як акцептор плюмбуму і таким чином зменшувати інтоксикацію організму?

А. Вода

В. Аналгетики

С. Розчин білка

D. Розчин глюкози

Е. Фізіологічний розчин

Індивідуальна самостійна робота студентів

1. Історія розвитку біохімії: становлення біохімії як науки, напрямки розвитку сучасної біохімії.

2. Основоположні відкриття в галузі структури та функціональної ролі білків і нуклеїнових кислот.

Література

Основна:

1. Біологічна хімія. Тести та ситуаційні задачі. / За ред. О.Я. Склярова. – К.: Медицина, 2010. – 360 с.

2. Біохімічні показники в нормі і при патології. Довідник / За ред. Склярова О.Я. – К.: Медицина, 2007. – 320 c.

3. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – 744 с.

4. Губський Ю. І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – 7 – 40 с.

5. Губський Ю. І. Біологічна хімія. – Київ-Вінниця: Новакнига, 2009. – 24 – 33 с.

6. Клінічна біохімія. Підручник / За ред. О.Я.Склярова. – Київ: Медицина, 2006. – 11 – 28 с.

7. Клінічна біохімія. Лекції для студентів медичного, стоматологічного та фармацевтичного факультетів/ За ред. О.Я. Склярова. – Львів, 2004. – 294 с.

8. Практикум з біологічної хімії / За ред. О.Я. Склярова. – К.: Здоров’я, 2002. – С. 3 – 46.

Додаткова:

1. Ангельскі С., Якубовскі З., Домінічак М. Г. Клінічна біохімія. – Сопот, 1998. – 451 с.

2. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1998. – 704 с.

3. Бышевский А.Ш., Терсенов О.А. Биохимия для врача. – Екатеринбург: Уральский рабочий, 1994. – 384 с.

4. Владика А. Особливості визначення загального білка сироватки крові // Клініко-лабораторна діагностика. – 1995. – № 3. – С. 10-12.

5. Клиническая биохимия: Учебное пособие для вузов / Бочков В.Н., Добровольский А.Б., Кушлинский Н.Е. и др. – М.: ГЭОТАР-МЕД, 2004. – 521 с.

6. Кучеренко М. Є., Бабенюк Ю. Д., Войціцький В. М. Сучасні методи біохімічних досліджень. – Київ: Фітосоціоцентр, 2001. – 424 с.

7. Сув’язь поколінь. Фармацевтичний факультет Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького / Зіменковський Б.С., Калинюк Т.Г. та ін. – Львів: Наутілус, 2009. – с. 414-447.

Тема № 2. Дослідження будови та фізико-хімічних властивостей білків-ферментів. Засвоєння методів виявлення ферментів у біологічних об’єктах.

Мета заняття: Засвоїти принципи організації та загальні властивості ферментів. Оволодіти методом визначення активності амілази слини і на її прикладі вивчити вплив температури та рН середовища на активність ферментів.

Актуальність теми: Ферменти – це біологічні каталізатори білкової природи, які забезпечують прискорення і координацію численних метаболічних процесів в живих організмах. Існують тисячі ферментів, які каталізують окремі хімічні перетворення або групи споріднених реакцій. Ферменти розрізняються за своєю будовою, наявністю небілкових компонентів, локалізацією, різними фізико-хімічними та каталітичними властивостями. Активність ферментів може змінюватись в широких межах в залежності від численних внутрішніх та зовнішніх факторів.

Конкретні завдання:

Ø Трактувати біохімічні закономірності будови та функціонування різних класів ферментів.

Ø На основі розуміння фізико-хімічних властивостей білків-ферментів пояснювати залежність активності ферментів від рН середовища, температури та інших факторів.

Ø Аналізувати активність ферментів плазми крові залежно від їх внутрішньоклітинної та тканинної (органної) локалізації.

Ø Аналізувати методи виявлення активності ферментів з метою їх оптимального застосування в клініко-лабораторному аналізі.

Теоретичні питання

1. Ферменти: визначення; властивості ферментів як біологічних каталізаторів реакцій обміну речовин.

2. Фізико-хімічні властивості білків-ферментів: електрохімічні (поверхневий заряд молекули) властивості, розчинність, термодинамічна стабільність білкових молекул-ферментів, осадження, денатурація, взаємодія з лігандами та її функціональне значення.

3. Прості та складні білки-ферменти. Кофактори, коферменти та простетичні групи складних ферментів. Навести приклади. Роль іонів металів у функціонуванні ферментів.

4. Будова ферментів: активний, регуляторний (алостеричний) центри, їх значення.

5. Рівні структурної організації ферментів. Мультиферментні комплекси, ферментативні ансамблі, поліфункціональні ферменти, їх переваги.

6. Номенклатура, класифікація, шифр ферментів. Типи реакцій, що каталізують окремі класи ферментів.

7. Властивості ферментів:

• залежність активності ферментів від рН середовища (пояснити і зобразити графічно);
• залежність активності ферментів від температури (пояcнити і зобразити графічно).

8. Специфічність ферментів. Види специфічності (абсолютна, відносна, стереоспецифічність). Навести приклади.

9. Внутрішньоклітинна локалізація ферментів. Навести приклади.

10. Тканинна (органна) специфічність ферментів. Навести приклади.

11. Методи визначення ферментів у біологічних об’єктах (кров, слина, сеча, окремі тканини).