Классическая цитогенетика.

Различают прямые и непрямые цитогенетические методы, направленные на изучения числа и структуры хромосом. При использовании прямых методов из организма пациента аспирируют (забирают) делящиеся клетки из тканей с высоким митотическим индексом. Так например, при гематологических болезнях (наследственные анемии) пунктируют клетки красного костного мозга, при кариотипировании плода - клетки хориона, для обнаружения половых хромосом - клетки буккального эпителия слизистой рта.

При применении непрямых методов изучают хромосомы дифференцированных клеток, чаще всего лимфоцитов периферической крови. Лимфоциты помещают в питательную среду, стимулируют их деления добавлением специальных веществ (ФГА), а затем останавливают деления и подвергают клетки осмотическому шоку для получения метафазных пластин хромосом. Для анализа хромосом необходимо проведение их рутинного или дифференциального окрашивания с последующим микроскопированием при увеличении в 1300 раз.

1)Тотальное (рутинное) окрашивание предполагает равномерное окрашивание хромосом по всей длине и позволяет подсчитать количество хромосом, т.е. выявить геномные мутации. К известным у человека изменениям числа хромосом, совместимым с жизнью, относятся - моносомия (2n-1) по половым хромосомам (с.Шерешевского-Тернера- 45, ХО), а также трисомии (2n+1) по аутосомам и по половым хромосомам (с. Дауна -47, ХХ+21 и с. Кляйнфельтера - 47, ХХУ).

2)Дифференциальное окрашивание направлено на анализ рисунка или чередования светлых и темных бэндов хромосом. В виде темных бэндов (полос или дисков) виден гетерохроматин, а менее окрашенные или светлые участки соответствуют эухроматину (междиски). При изучении кариотипа человека чаще всего используют G-окрашивание АТ-богатых участков гетерохроматина.

Дифференциальная окраска предполагает выявление тонкой структуры хромосом - хромосомных перестроек или аббераций. Кроме того, возможно выявление мозаичных форм по геномным мутациям. Мозаиками называют людей, часть клеток которых несет хромосомную мутацию, а часть – нет. Мозаицизм по геномным мутациям может возникать на первых этапах дробления зиготы из-за нарушения расхождения хроматид. В результате отдельные бластомеры будут иметь нормальный набор хромосом, а другие -аномальный. При мозаичных формах с. Кляйнфельтера (47, ХХУ/46, XY), с. трисомии по Х-хромосоме (47, ХХХ/46X), с.Шерешевского-Тернера (45, ХО/46XX), мозаики могут иметь близкие к норме показатели умственного развития и фертильности.

Обнаружение хромосомных мутаций на стадии метафазы митоза с помощью дифференциальной окраски возможно, только если хромосомная перестройка достаточно крупная.

С помощью цитогенетического метода возможна экспресс-диагностика изменений числа половых хромосом путем определения телец Барра или полового хроматина в ядрах лимфоцитов или в клетках буккального эпителия слизистой щеки. Известно, что у особей женского пола одна из Х-хромосом инактивируется. При анализе женского кариотипа инактивированная Х-хромосома выглядит в виде хорошо окрашенной компактной глыбки хроматина, расположенной под ядерной оболочкой. Эту структуру называют половой хроматин или тельце Барра. Его обнаружение является самым простым способом цитогенетического определения половой принадлежности. Инактивация Х-хромосомы достигается путем ее суперспирализации, что приводит к невозможности транскрипции генов и выключает последние. В Х-хромосоме идентифицировано более 1000, а в Y-хромосоме только 100 генов, поэтому инактивация одной из Х-хромосом приводит к уравниванию дозы работающих генов у мужчин и женщин. Такое явление называют эффектом дозовой компенсации. При экспресс-диагностике используют рутинную окраска ацетоорсеином, позволяющую увидеть на периферии ядер клеток эпителия щеки у женщин (46, ХХ) одну темную глыбку хроматина - тельце Барра. В норме половой хроматин должен быть найден в 10-30 клетках из 100, поскольку только 10-30% этих клеток находится в состоянии интерфазы, а остальные делятся.

Выявление У-хроматина на У-хромосоме проводят с помощью Q-окраски, с использованием люминесцентного красителя, который светится в УФ свете. У мужчин на периферии ядра будет видно столько ярких светящихся точек, сколько в клетке У-хромосом. Эту окраску называют иначе " бриллиантовое свечение".

3.1.2.Молекулярная цитогенетика.

Наиболее часто используемым методом молекулярной цитогенетики является FISH-метод или флюоресцентная гибридизация in situ (от англ. Fluorescence in situ hybridization – FISH на месте). Метод применяют для идентификации хромосом и для определения на них положения специфических последовательностей ДНК с использованием ДНК-зондов с флуоресцирующими метками, которые видны при УФ освещении. ДНК-зондом называют искусственно синтезированную короткую одноцепочечную нить ДНК, комплементарную участку ДНК на изучаемой хромосоме. С помощью этого метода можно выявлять некрупные хромосомные перестройки (около 5 млн. п.н.). Хотя цифра в 5 Мв выглядит внушительно, стоит вспомнить, что размер самой маленькой аутосомы человека (21) – 50 Мв, 22- 56 Мв. У-хромосома имеет длину 28Мв, а самая длинная аутосома (№1) – 236 Мв.