Метод РН дифференциальной спектрофотометрии определения массовой доли суммы антоцианинов в соковой продукции.

Цель занятия: ознакомление с методом рН-дифференциальной спектрофотометрии для определения массовой доли суммы антоцианинов в концентрированных соках.

Нижний предел измерений массовой концентрации (массовой доли) суммы антоцианинов составляет 5 мг/дм (мг/кг) (млн^-1). Верхний предел измерений массовой концентрации (массовой доли) 5000 мг/дм (мг/кг) (млн^-1).

Термины и определения

В настоящей методике применен следующий термин с соответствующим определением:

антоцианины: Водорастворимые растительные пигменты, обусловливающие красную, синюю и фиолетовую окраску фруктов, относящиеся к классу флавоноидов и представляющие собой гликозиды антоцианидинов.
Структура основных антоцианидинов, входящих в состав природных антоцианинов, приведена на рисунке 2.2.1.

Рис 2.2.1 Общая структура антоцианидинов

Примечание: Конкретный вид антоцианидина зависит от состава радикалов R , ₁ R₂ , приведенных в таблице 2.2.1

Таблица 2.2.1

Виды антоцианидинов в зависимости от состава радикалов

Вид антоцианидина	Состав радикалов	Сокращенное наименование
R1	R2
Пеларгонидин	H	H	Pgd
Цианидин	OH	H	Cyd
Пеонидин	OCH	H	Pnd
Дельфинидин	OH	OH	Dpd
Петунидин	OCH	OH	Ptd
Мальвидин	OCH	OCH	Mvd
Примечание - R 3 и R 4- Н или гликозиды.

Особенностями строение антоцианидинов объясняется разнообразие их окраски. Образование комплексов с ионами К дает пурпурно-красную окраску, с ионами Mg и Са – синюю и зависит от рН среды. При рН < 6 окраска антоцианов красная различной интенсивности (наиболее яркая при рН = 1 – 2), при рН = 6 – фиолетовая, рН = 8 – синяя, рН= 10 – зеленая.

Исследования показали несомненную пользу потребления таких растительных пищевых продуктов для укрепление и оздоровления организма человека, в особенности для уменьшения риска возникновения онкозаболеваний, которые, к сожалению, стали в последнее время весьма распространены.

Растительные продукты, содержащие антоцианы, помогают бороться со следующими недугами и состояниями: процессы старения и неврологические болезни, бактериальные инфекции, рак, диабет, воспалительные процессы.

К продуктам, содержащим рекордное количество антоцианов, относят: ежевику, чернику, вишню, клюкву, баклажаны (кожица), краснокочанную капусту, малину.

Материалы и оборудование

1. Спектрофотометр UV–mini Shimadzu (Япония) позволяющий проводить измерения при длинах волн от 200 до 900 нм, допустимая абсолютная погрешность измерения коэффициента пропускания - не более 1%.

2. Кюветы кварцевые для спектрофотометрии с длиной оптического пути 10 мм.

3. Весы лабораторные по ГОСТ 24104 с пределами абсолютной погрешности однократного взвешивания ±0, 1 мг.

4. Установка ультразвуковая с частотой ультразвука 43-45 кГц.

5. Фильтры мембранные с диаметром пор 0, 45 мкм.

6. Центрифуга лабораторная с фактором разделения (g-фактор) 800-1000.
8. Буферные растворы с рН 1 и 4, 5.

Сущность метода рН-дифференциальной спектрофотометрии

Метод основан на применении рН-дифференциальной спектрофотометрии. Массовую долю антоцианинов в продукции определяют на основе изменения поглощения света с длиной волны 510 нм при изменении кислотности растворов соковой продукции с рН от 1 до 4, 4.

Приготовление буферного раствора с рН 1, 0

1, 49 г хлористого калия (КСI) помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают.

75 мл дистиллированной воды помещают в мерную колбу 100 мл и осторожно приливают 1, 7 мл концентрированной соляной кислоты, доводят до метки и перемешивают (раствор молярной концентрации 0, 2 моль /л).

Затем в стакане вместимостью 100 мл смешивают 25 мл полученного раствора КСI с 67 мл раствора НСI молярной концентрации 0, 2 моль / л. При необходимости значение рН полученного буферного раствора доводят до 1, 0 концентрированной соляной кислотой.

Приготовление буферного раствора с рН 4, 5

1, 64 г уксуснокислого натрия помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают. Доводят значение рн раствора до 4, 5 концентрированной соляной кислотой.

Проведение измерений

Подготовка проб для анализа.
Навеску испытуемой пробы массой 5 г, взвешенную с точностью не более 0, 0005г, помещают в стаканчик вместимостью 50 мл, растворяют в 20 мл дистиллированной воды и количественно переносят в мерную колбу на 25 мл. Стаканчик несколько раз ополаскивают дистиллированной водой, раствор переносят в мерную колбу, доводят дистиллированой водой до метки и перемешивают. Полученный раствор фильтруют через фильтры с размером пор 0, 45 мкм

Затем в две мерные колбы вместимостью 25 мл отбирают по 0, 5 мл приготовленного раствора и доводят их до метки буферными растворами c pH 1, 0 и 4, 5 (соотношение двух взятых объемов 25 см и 0, 5 мл составляет величину разведения (50), используемую при расчете массовой доли

антоцианинов по формуле (2).

Растворы перемешивают и выдерживают в течение 15 мин до начала измерений и проводят измерение оптической плотности при длинах волн 510 и 700 нм для определения массовой доли антоцианов.

Значения оптической плотности должны находиться в пределах 0, 2-1, 0.
Для проб продукции, имеющих значения оптической плотности раствора более 1, 0, повышают величину разведения.
Для проб продукции, имеющих значения оптической плотности раствора менее 0, 2, уменьшают величину разведения.
Измерения оптической плотности подготовленных проб проводят на спектрофотометре при длинах волн 510 и 700 нм. Измеряемой величиной является разность в оптической плотности растворов с рН 1, 0 и 4, 5 при длинах волн 510 и 700 нм, которая пропорциональна массовой доле антоцианинов в исследуемом растворе.

Измерение оптической плотности при 700 нм проводят для установления величины поглощения света посторонними примесями в анализируемой соковой продукции.

Пробы анализируют два раза в условиях повторяемости.

Обработка результатов спектрофотометрических измерений

Вычисления массовой доли суммы антоцианинов проводят до третьего десятичного знака в следующем порядке.

Оптическую плотность суммы антоцианинов рассчитывают как разность оптических плотностей растворов при разных длинах волн и значениях pH по формуле

Массовую долю суммы антоцианинов С(Х), млн^-1, в пересчете на цианидин-3-глюкозид рассчитывают по формуле:

С(Х) = 3,

(2)

где A- измеренная оптическая плотность суммы антоцианинов;
M(X) - молекулярная масса цианидин-3-глюкозида, равная 449, 2 г/моль;
R - величина разведения;
V - объем буферного раствора, мл
ε - молярный коэффициент экстинкции цианидин-3-глюкозида, равный 26900 [моль·см/дм³]^-1;
l - длина оптического пути кюветы, равная 1 см;
m(X) - масса анализируемой пробы, г.

Млн^-1 = 1 ррм = 1 г/т = 1 мг/кг

Расхождение между двумя параллельными определениями (в процентах от среднего значения), выполненными в условиях повторяемости, не должно превышать 8 %, при вероятности 0, 95 и значении показателя массовой доли суммы антоцианинов в диапазоне от 1000 до 5000 включ. млн^-1