Основной принцип хроматографического разделения.

Хроматография - это метод разделения и анализа смесей веществ, основанный на различном распределении компонентов смеси между двумя несмешивающимися фазами - одна из которых должна быть подвижной (ПФ), а другая неподвижной (НФ). Компоненты смеси, растворенные в ПФ, при контакте с поверхностью НФ распределяются между ПФ и НФ в соответствии с их свойствами (адсорбируемостью, растворимостью, ионной силой и др.). Устанавливается динамическое равновесие, вследствие чего молекулы разделяемой смеси часть времени находятся в НФ, а часть - в ПФ.

В данном случае улавливание и удаление молекул, выходящих с поверхности раздела фаз (из неподвижной фазы), осуществляется благодаря постоянному движению одной из фаз (а именно подвижной фазы). Выходящие из неподвижной фазы молекулы, как и при фазовом равновесии, попадают в нее снова, однако при достаточно быстром движении подвижной фазы они не достигают прежнего элемента объема неподвижной фазы, а попадают в ближайший элемент объема в направлении потока.

Вдоль хроматографической системы движутся только те молекулы, которые находятся в ПФ. Разные вещества обладают различным сродством к ПФ и НФ. Вещество, сильнее взаимодействующее с НФ, будет медленнее двигаться через хроматографическую систему по сравнению с веществом, слабее взаимодействующим с НФ.

Высокая эффективность разделения может быть достигнута только благодаря частым фазовым переходам, поэтому неподвижная и подвижная фазы должны иметь большую поверхность соприкосновения, а внешние условия должны быть выбраны так, чтобы молекулы разделяемых веществ были способны к быстрому обмену между двумя фазами. Так как эффективность разделения снижается вследствие диффузионных явлений, то обе фазы всюду должны иметь небольшую толщину слоя, а поток подвижной фазы должен быть ламинарным.

Истинное равновесие между двумя фазами достигается в тем меньшей степени, чем больше скорость подвижной фазы. Так как компоненты смеси, погло­щенные в данный момент сорбентом, не участвуют в движении подвижной фазы, то каждому из них для прохождения колонки в общем требуется больше времени, чем для любой из молекул подвижной фазы. Разделение смеси достигается, если компоненты смеси обладают различными коэффициентами распределения между обеими фазами, т. е. если неподвижная фаза по-разному препятствует их прохождению по колонке.

В настоящее время хроматография применяется со многими методическими изменениями, которые имеют одну общую основу: разделение происходит вследствие частого перехода молекул отдельных компонентов смеси между двумя фазами, из которых одна является неподвижной фазой с развитой поверхностью, а вторая фаза (подвижная) перемещается относительно нее. Благодаря различному распределению разделяемых веществ между неподвижной и подвижной фазами они испытывают разное замедление в своем движении вдоль колонки.

ВЭЖХ делится на адсорбционную, распределительную, ионообменную и эксклюзионную в зависимости от механизма разделения анализируемых веществ.

В адсорб­ционной хроматографии разделение веществ смеси, движущихся по колонке в потоке растворителя, происходит за счет их различной способности адсорби­роваться и десорбироваться на поверхности адсорбента с развитой поверхностью, например, силикагеля.

В распределительной ВЭЖХ разделение происходит за счет того, что разделяемые вещества из-за различной их растворимости между неподвижной и подвижной фазами, по–разному распределяются. Неподвижной фазой, как правило, служит сорбент, с которым стационарная фаза связана химической связью, а подвижной – растворитель. Этот метод разделения наиболее популярен, особенно в случае, когда привитая фаза представляет собой неполярный алкильный остаток от С8 до С18, а подвижная фаза более полярна, например смесь метанола или ацетонитрила с водой. Этим вариантом так называемой обращенно-фазной (или обратно-фазной, или с об­ращением фаз) хроматографии в настоящее время проводят около двух третей разделений в ВЭЖХ.

В ионообменной хроматографии молекулы веществ смеси, диссоциировавшие на катионы и анионы в растворе, разделяются при движении через сорбент, на поверхности которого привиты катионные или анионные центры, способные к обмену с ионами анализируемых веществ за счет их разной скорости обмена.

В эксклюзионной (ситовой, гельпроникающей, гель-фильтрационной) хроматографии молекулы веществ разделяются по размеру за счет их разной способности проникать в поры носителя. При этом первыми выходят из колонки наиболее крупные молекулы (наибольшей молекулярной массы), способные проникать в минимальное число пор но­сителя. Последними выходят вещества с малыми размерами молекул, свободно проникающие в поры сорбента.