Критерии оценки увеличения проницаемо­сти цитоплазматической мембраны

Уменьшение электрического сопротивления ткани. Мет одом оценки проницаемости мембран для ионов мо­жет служить изменение электрического сопро­тивления (импеданса) ткани. Последний вклю­чает в себя омическую и емкостную составляю­щие, поскольку каждая клетка представляет собой как бы систему конденсаторов (биологи­ческие мембраны) и резисторов (биологические мембраны, межклеточная жидкость и цитоплаз­ма). При повреждении клеток наблюдается уменьшение омического сопротивления тканей, связанное в основном с возрастанием ионной проницаемости клеточных мембран.

Окраска цитоплазмы различ­ными красителями. Вод ораствори-мые красители плохо проникают через мембра­ны неповрежденных клеток и потому слабо про­крашивают внутриклеточные структуры. Увели­чение проницаемости цитоплазматических и внутриклеточных мембран при повреждении клетки приводит к возрастанию количества кра­сителя, вошедшего в клетку и внутриклеточные структуры. На этом основаны многие гисто (цито)-химические методы определения жизне­способности клеток.

Снижение мембранного потен­циала покоя. Разность электрических потенциалов между содержимым клетки и ок­ружающей средой (мембранный потенциал по­коя) создается, как известно, в основном диффу­зией ионов калия из клетки в окружающую сре­ду. Неравномерное распределение ионов между клеткой и окружающей средой, лежащее в ос­нове генерации электрических потенциалов на мембране, обеспечивается постоянной работой молекулярных ионных насосов (Na⁺-K⁺- АТФа-

Часть I. ОБЩАЯ НОЗОЛОГИЯ

Ранние изменения в функционировании внутриклеточных структур при повреждении

Таблица

Изменение	Проявление
Увеличение проницаемости цитоплазматической мембраны	Увеличение электропроводности ткани Увеличение связывания красителей Изменение мембранного потенциала Выход ионов калия из клетки Выход метаболитов Увеличение обьема (набухание) клеток Увеличение внутриклеточной концентрации ионов кальция
Нарушение структуры и функций митохондрий	Снижение потребления кислорода Увеличение проницаемости внутренней митохондриальнои мембраны Набухание митохондрий Снижение кальцийаккумулирующей способности
Ацидоз	Активация Ма*/Н+-обмена. Повышение внутриклеточной концентрации ионов натрия Набухание клеток
Повреждение эндоплазма-тического ретикулума	Выход Са2+ в цитоплазму, нарушение системы синтеза белка
Изменение активности ферментов и рецепторов	Активация ферментов лизосом Активация эндонуклеаз - апоптоз
Повреждение генетического аппарата клетки	Повреждение рибосом

зы и Ca^2f - Mg²* -АТФазы), встроенных в мемб­раны клеток. Так, внутри клеток содержание Са^2т примерно в 10000 раз ниже, чем в окружающей среде; в клетках гораздо больше К⁴ и меньше Na*, чем в плазме крови или межклеточной жидкости (табл. 9). Благодаря различию в кон­центрации ионов в клетке и окружающей среде на цитоплазматической мембране имеется раз­ность потенциалов со знаком «минус» внутри клетки (около 70 мВ для нервных и мышечных клеток). Уменьшение мембранного потенциала покоя при действии повреждающих факторов происходит как в результате неспецифического увеличения ионной проницаемости, так и при уменьшении градиентов концентрации ионов ■ следствие выключения работы ионных насосов; последнее происходит как при прямом повреж­дении Na⁺-K*-AT< Pa3bi, так и при снижении уров­ня АТФ вследствие нарушения биоэнергетичес­ких процессов в митохондриях. Например, ус­тановлено снижение мембранного потенциала покоя клеток печени у лабораторных животных при асфиксии. Снижение мембранного потенци­ал наблюдается также при ХОЛОДОВОМ, радиа­ционном, аллергическом и других повреждени­ях клеток, лизосом и прочих субклеточных структур.

Выход ионов калия из кле­ток. При активно работающей Ка⁺-К⁺-АТФазе на цитоплазматической мембране поддержива­ется разность потенциалов со знаком «минус» внутри клетки, под действием которой ионы калия входят в клетку. Этот постоянный поток К* внутрь клетки компенсирует спонтанный выход калия наружу, который происходит в силу диффузии этих катионов из области с более вы­сокой концентрацией калия в область с более низкой его концентрацией. Повреждение клет­ки сопровождается снижением содержания в ней АТФ, падением электрического потенциала на цитоплазматической мембране, повышением со­держания внутриклеточного Са²' и выходом ка­лия из клеток. Освобождение калия из клеток описано при механической травме, различных интоксикациях, аллергических состояниях, ги­поксии и многих других повреждениях органов и тканей. Понижение содержания ионов калия в клетке может происходить также под влияни­ем больших доз минералокортикоидных гормо­нов, при действии некоторых лекарственных веществ, например сердечных гликозидов. В свою очередь, увеличение концентрации калия во внеклеточной среде приводит к снижению мем­бранного потенциала соседних клеток, что в слу-

Глава 3 / МЕСТНЫЕ И ОБЩИЕ РЕАКЦИИ ОРГАНИЗМА НА ПОВРЕЖДЕНИЕ

Распределение ионов калия и натрия и снаружи некоторых клеток

Таблица 9

чае электровозбудимых тканей может вызвать генерацию потенциалов действия. Так, увеличе­ние концентрации калия в очаге инфаркта мио­карда может стать одной из причин возникнове­ния фибрилляции сердца.

Накопление ионов кальция в цитоплазме. В нормальных клетках кон­центрация ионов кальция в цитоплазме харак­теризуется исключительно низкими значения­ми: 10 ⁷ или даже 10⁸ М, тогда как в окружаю­щей клетку среде содержится 10³ М ионов каль­ция. При этом следует иметь в виду, что ионы кальция проходят в клетку не только самопро­извольно (процесс «утечки» через мембрану), но и (в некоторых клетках) через кальциевые ка­налы в мембране. Эти каналы могут открывать­ся в ответ на изменение мембранного потенциа­ла, присоединение гормонов и медиаторов к мем­бранным рецепторам. Компенсирует вход ионов Са²⁺ в клетку работа трех типов кальцийтранс-портирующих систем: кальциевый насос (Са²*-Mg³'-AT< Pa3a) в мембранах саркоплазматического ретикулума и клеточной мембране, система ак­кумуляции Ca^2f в митохондриях, и в некоторых клетках, Ма⁺/Са²⁺-обменник, встроенный в ци-топлазматическую мембрану.

При повреждении клетки нарушается работа митохондрий: снижается мембранный потенци­ал и прекращается окислительное фосфорили-рование. При снижении мембранного потенциа­ла в митохондриях уменьшается поглощение этими структурами Са²⁺. Снижение уровня АТФ в клетке приводит к выключению работы Са²¹-! У^²'-АТФазы цитоплазматической и мембран саркоплазматического ретикулума. Все это спо­собствует накоплению кальция в цитоплазме. Увеличение концентрации Na' в клетке вслед­ствие угнетения натриевого насоса при недостат­ке АТФ приводит к выключению и NaVCa²*-o6-мена через клеточную мембрану. В результате

всего этого происходит увеличение концентра­ции кальция от 10 ⁸-10 ⁷М (в норме) до 10 ^б-10 ⁵ М. Это приводит к активации большого числа кальцийзависимых ферментов (протеин-киназ, фосфолипаз, фосфодиэстеразы цикличес­ких нуклеатидов и др.), нарушениям в цитоске-лете, активации сократительных структур, об­разованию нерастворимых включений кальция в матриксе митохондрий, повреждению внутри­клеточных мембран и общей дезорганизации ме­таболизма. Морфологически это проявляется в замедлении броуновского движения различных включений внутри клетки (увеличение «вязкос­ти протоплазмы») и возрастании светорассеяния; красители начинают легче проникать в клетку и связываются в большом количестве с внутри­клеточными структурами - все эти признаки типичны для «неспецифической реакции клет­ки на повреждение» по Насонову и Александро­ву (см. выше).

Выход метаболитов. Увеличение проницаемости мембраны клеток и ухудшение работы ионных насосов приводит к тому, что ком­поненты цитоплазмы выходят в окружающую среду. Вышедшие из клеток вещества отнюдь не безразличны для других клеток, тканей и орга­нов. Так, среди веществ, выходящих из клеток, поврежденных в результате ишемии (нарушения кровотока) или ожога, имеются полипептиды, обладающие способностью вызвать остановку сердца (ишемический, ожоговый токсины). Об­наружение этих веществ осуществляется различ­ными методами, включая измерение хемилюми-несценции плазмы крови, интенсивность кото­рой снижается в присутствии полипептидных токсинов.

Увеличение объема (набуха­ние) клеток. Увеличение объема клеток -один из наиболее ранних признаков ее повреж­дения, который проявляется, например, при не-

Часть I. ОБЩАЯ НОЗОЛОГИЯ

достатке кислорода в ткани - тканевой гипок­сии. Сохранение нормальной формы и объема клеток связано с состоянием цитоскелета и под­держанием определенного соотношения между осмотическим давлением белков и электролитов внутри и вне клетки. При этом форма клетки эпределяется в значительной мере цитоскелетом, тогда как объем - поддержанием осмотического баланса. Поскольку все биологические мембра­ны хорошо проницаемы для воды, но плохо про­ницаемы для большинства растворенных в воде веществ, включая соли, клетки, так же как и внутриклеточные структуры, например митохондрии, обладают свойством осмометра: их объем изменяется при изменении концентрации ионов в молекул внутри и вне клетки или органеллы. При этом строго поддерживается соотношение концентраций всех ионов и молекул внутри и вне клетки. Как только в клетке начинают на­капливаться новые ионы и молекулы, ее объем ■ •врастает, поскольку вода входит внутрь. Вы­качивание ионов мембранными насосами и обменниками сопровождается уменьшением ее объема за счет самопроизвольного выхода избыт­ка воды.

В нормальной клетке имеется, как правило, избыточное по сравнению с окружающей средой количество белков, что приводило бы к появле­нию избыточного осмотического (онкотическо-)) давления и увеличению объема клетки, если бы одновременно не происходило удаление (вы-■ ичивание) ионов натрия из клетки за счет ра- iaibi Ка⁺-К⁺-АТФазы. Вместе с натрием, кото-¹ выкачивается ионными насосами за счет энергиигидролиза АТФ, происходит выход ионов за счет электрического поля, создаваемо-(диффузией ионов калия и переносом Na*, так ак мембрана клеток хорошо проницаема для ионовхлора. Иначе говоря, натриевый насос ■ *-К*-АТФаза) удаляет из клетки NaCl и сни­кает концентрацию ионов в ней, что приводит уменьшению клеточного объема. Этому про­весу противостоит процесс самопроизвольного вступления натрия внутрь клетки: через дефект влипидном бислое, через натриевые каналы, арез переносчики, сопрягающие вход натрия с рнвепортом Сахаров и аминокислот в клетку, ' Н~- и Ма⁺/Са²*-обменники. Таким образом, ззая клетка находится в состоянии динамического равновесия, при котором «протечка» елочной мембраны компенсируется постоянно.

ной работой ионной помпы (это так называемая leak and pump - гипотеза).

При патологии может происходить либо уве­личение ионной проницаемости клеточной мем­браны (возрастание «протечки»), либо наруше­ние работы ионных насосов (например, при не­достатке энергообеспечения). В опытах с изоли­рованными клетками печени, почек, мозга было показано, что отравление солями ртути или дру­гих тяжелых металлов приводит к увеличению ионной проницаемости мембраны клеток (уве­личению «протечки») и возрастанию объема кле­ток (т. е. набуханию ткани). Увеличение объема клеток можно вызвать и другим способом: нару­шив систему их энергообеспечения. Действитель­но, было показано, что объем клеток возрастает при гипоксии (например, при действии цианида или окиси углерода) и под влиянием разобщите­лей окислительного фосфорилирования, таких как динитрофенол.

Набухание клеток - процесс, далеко не без­различный для функционирования клеток и тка­ни в целом. Первым результатом этого оказыва­ется сдавливание кровеносных сосудов и затруд­нение кровообращения. Так, при ишемии про­исходит набухание клеток и последующее общее возобновление кровообращения не сразу и не всегда приводит к восстановлению жизнедеятель­ности ткани, потому что кровь не проникает в мелкие кровеносные сосуды, сдавленные набух­шими клетками. То же происходит при транс­плантации органов. Иногда применяется пред­варительное промывание пересаженного органа гипертоническим раствором, который восстанав­ливает прежний объем клеток и нормализует микроциркуляцию.

Нарушение структуры и функций митохондрий

Нарушение биоэнергетических функций ми­тохондрий - одно из наиболее ранних проявле­ний повреждения клеток. Например, после пре­кращения кровообращения происходит наруше­ние окислительного фосфорилирования в мито­хондриях через 20-30 мин в печени и через 30-60 мин - в почках. Приблизительно в эти же сроки появляются и другие признаки поврежде­ния клеток.

Изучение нарушения функций митохондрий производится после выделения этих органелл из ткани; при этом важно не повредить митохонд-

Глава 3 / МЕСТНЫЕ И ОБЩИЕ РЕАКЦИИ ОРГАНИЗМА НА ПОВРЕЖДЕНИЕ 71

рии в ходе их выделения. Один из способов изу­чения функции митохондрий - измерение ско­рости потребления кислорода суспензией орга-нелл в различных функциональных состояниях методом полярографии. На рис. 1 приведено из­менение концентрации кислорода в среде инку­бации изолированных митохондрий. Наклон кривой в каждый момент времени характеризу­ет скорость потребления кислорода (дыхания) в данном состоянии. Эти величины принято обо­значать как V_v V₂, V₃, V₄ и т.д., где цифрами обозначены состояния по классификации Б. Чан-са. Наиболее информативны V₃ - скорость дыха­ния митохондрий при окислительном фосфо-рилировании, т. е. в присутствии субстратов окисления, АДФ и ортофосфата, и К, - скорость дыхания митохондрий в присутствии субстратов окисления и ортофосфата, но в отсутствие АДФ (состояние дыхательного контроля).

Снижение потребления кис­лорода. Уменьшение скорости потребления кислорода митохондриями, связанное с наруше­нием работы переносчиков электронов, наблю­дается при действии многих токсических соеди­нений, например ионов тяжелых металлов, та­ких как ртуть или серебро, ряда гидрофобных соединений, различных производных углеводо­рода, при перекисном окислении липидов. Оно может быть также следствием набухания мито­хондрий и разрыва их наружных мембран, в результате чего из митохондрий выходит цито-хром с, который является одним из переносчи­ков электрона по дыхательной цепи.

Увеличение проницаемости

внутренней митохондриальной мембраны.

Низкая скорость дыхания мито­хондрий в состоянии 4 (см. рис. 1) связана с тем, что высокий мембранный потенциал (создавае­мый в отсутствие АДФ и при наличии кислоро­да и субстратов) препятствует переносу прото­нов через внутренние мембраны, связанному с работой дыхательной цепи, и тем самым оста­навливает поток электронов по этой цепи. Утеч­ка ионов снижает мембранный потенциал и при­водит к увеличению скорости дыхания (V₄). По­этому рост V_t - свидетельство увеличения про­ницаемости внутренних мембран митохондрий. В митохондриях К, растет при повреждении орга-нелл в результате гипоксии или пероксидации липидов.

Анализ полярографических кривых позволя­ет определить два взаимосвязанных показателя работоспособности митохондрий. Первый - это коэффициент Р/0, который рассчитывается как отношение

Р моли синтезированного АТФ

О моли поглощенного кислорода

Второй показатель - коэффициент дыхатель­ного контроля (ДК), который находят как отно­шение

RK=VJV₄.

Снижение ДК до единицы сопровождается снижением коэффициента Р/0 до нуля и явля­ется свидетельством разобщения процессов окис­ления и фосфорилирования в митохондриях при их повреждении.

Снижение способности на­капливать кальций. Параллельно разобщению окислительного фосфорилирования наблюдается потеря способности митохондрий к накоплению ионов кальция. В присутствии из­бытка субстратов дыхания и при наличии кис­лорода и ортофосфата митохондрии печени спо­собны накопить в матриксе количество фосфор­нокислого кальция, по массе превышающее мас­су митохондрий в сотни и даже в тысячу раз! Повреждение митохондрий приводит к падению разности потенциалов на митохондриальной мем­бране. Положительно заряженные ионы кальция, удерживаемые в матриксе электрическим полем, начинают выходить наружу из поврежденных митохондрий.

Часть I. ОБЩАЯ НОЗОЛОГИЯ

Разобщение окислительного фосфорилирова-ния и выход кальция из митохондрий имеют самые драматические последствия для клетки. Снижение уровня АТФ в клетке приводит к вык­лючению ионных насосов, выходу калия и вхож­дению ионов натрия и кальция в клетку из ок­ружающей среды. Это, в свою очередь, приво­дит к активации целого комплекса ферментных систем, активируемых ионами кальция, вклю­чая фосфолипазы, многие системы биосинтеза и протеинкиназы; метаболизм клетки вначале ак­тивируется, а затем дезорганизуется. Именно повреждение митохондрий является, согласно современным представлениям, тем переломным моментом, после которого изменения в клетке, вызванные повреждающим агентом, становятся необратимыми и клетка погибает.

Набухание митохондрий. Весьма важным морфологическим признаком повреж­дения митохондрий является их набухание. На­бухание митохондрий наблюдается, например, в клетках миокарда при недостаточности серд­ца, а также при многих инфекционных, гипоксических, токсических и других патологических процессах. Набухание митохондрий происходит при помещении клеток в гипотоническую сре­ду, под влиянием ионизирующей радиации, бак­териальных токсинов, при действии химических ядов и других патогенных агентов на клетку. Набухание приводит сначала к разрывам наруж­ных мембран митохондрий, а затем - к их пол­ному разрушению.

В опытах с изолированными митохондриями показано, что существует два типа набухания: пассивное и активное. В противоположность цитоплазматической мембране, сравнительно хорошо проницаемой для ионов калия и хлора, внутренние мембраны митохондрий непроница­емы для ионов, за исключением Са²' и, возмож­но, ионов железа. В изотоническом растворе КС1 неповрежденные митохондрии сохраняют свой объем, несмотря на то, что концентрация ионов калия и хлора внутри существенно меньше, чем снаружи: осмотическое давление внутри созда­ется и другими ионами, а также белками мат-рикса. При одновременном увеличении прони­цаемости для ионов калия и хлора они начина­ют диффундировать в митохондрии, что приво­дит к повышению осмотического давления, вхо­ду воды и набуханию органелл, которое называ­ется пассивным, так как не зависит от дыхания

и энергизации. К агентам, вызывающим пассив­ное набухание, относятся ионы тяжелых метал­лов, включая ртуть, серебро, свинец. Таким же действием обладает и избыточная активация перекисного окисления липидов в мембранах митохондрий.

В условиях живой клетки чаще имеет место иной тип набухания - активное набухание, свя­занное с работой цепи переноса электронов. По­вреждение митохондрий происходит под действи­ем малых доз тяжелых металлов, активации соб­ственной фосфолипазы в условиях гипоксии, при перекисном окислении липидов и сопровожда­ется прежде всего повышением проницаемости внутренней мембраны для катионов. В присут­ствии источников энергии (субстраты дыхания и кислород, АТФ) на мембранах митохондрий генерируется разность потенциалов величиной около 170-180 мВ со знаком «минус» в матриксе, под действием которой ионы К* поступают внутрь поврежденных митохондрий. Вместе с калием в матрикс поступает ортофосфат, кото­рый переносится в электронейтральной форме через внутреннюю мембрану с помощью специ­ального белкового переносчика. Активное (т. е. связанное с затратой энергии) накопление фос­фата калия в матриксе сопровождается набуха­нием митохондрий.

Ацидоз

Любое повреждение клетки сопровождается ацидозом ее цитоплазмы (рН падает до 6 и ниже). Первичный ацидоз повреждения клеток следу­ет отличать от вторичного ацидоза в воспален­ной ткани, который возникает значительно поз­днее (спустя несколько часов) после нанесения повреждения. Первичный ацидоз повреждения - следствие накопления в клетке определенных продуктов метаболизма (например, молочной кислоты). Первичный ацидоз в поврежденной ткани возникает при действии различных по­вреждающих агентов: механического воздей­ствия, действия химических агентов (например, горчичного масла), бактериальных токсинов (ди­зентерийная палочка, гемолитический стафило­кокк). Ацидоз повреждения возникает в тканях также при гипоксии.

Изменение активности ферментов и рецеп­торов. Активация ферментов лизосом

В поврежденных клетках происходит выход

Глава 3 / МЕСТНЫЕ И ОБЩИЕ РЕАКЦИИ ОРГАНИЗМА НА ПОВРЕЖДЕНИЕ

в цитоплазму и активация ряда гидролитичес­ких ферментов, в нормальных клетках заклю­ченных в специальные фосфолипидные везику­лы - лизосомы. Последние представляют собой образования диаметром порядка 0, 4 мкм и со­держат такие ферменты, как протеаза, рибонук-леаза, дезоксирибонуклеаза, кислая фосфатаза, гиалуронидаза и др. Различные повреждающие агенты, например эндотоксины бактерий брюш­нотифозной группы, а также мелкие неоргани­ческие частицы (двуокись кремния, двуокись титана, алмазная пыль), попадая в лизосомы, разрушают их. Активация лизосомальных фер­ментов может происходить не только под дей­ствием тех или иных специфических факторов, но и в результате ацидоза, характерного для не­специфической реакции клетки на повреждаю­щее воздействие. Одним из процессов, вызыва­ющих выход лизосомальных ферментов, явля­ется также активация пероксидации липидов в лизосомальных мембранах. До сих пор нет окон­чательной ясности в вопросе о том, является ли активация лизосом механизмом удаления содер­жимого пораженной клетки или причиной ее повреждения при действии неблагоприятных факторов.