Определение толерантности бактерий к антибиотикам

Первым этапом исследования является определение минимальной ингибирующей рост концентрации (МИК) используемого антибиотика с бактерицидным механизмом действия (например, бензилпенициллина) в отношении испытуемого штамма бактерий. Исследование проводят методом серийных разведении. После учета МИК антибиотика приступают ко второму этапу - определению минимальной бактерицидной концентрации антибиотика (МБК). Для этого из всех пробирок с антибиотиком, в которых отсутствует визуально рост бактерий, делают высев по 0, 1 мл на отдельные чашки с питательной средой (агар Хоттингера, МПА или 5% кровяной агар) и инкубируют при 35-37°С 18-24 ч. Определяют минимальную бактерицидную концентрацию антибиотика (МБК) по первой пробирке с антибиотиком, высев из которой не дал роста колоний бактерий. Для выявления толерантности бактерий к антибиотику сопоставляют его МИК и МБК. Испытуемый штамм бактерий считается толерантным к антибиотику если это соотношение ³ 32.

Ускоренные методы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам

В практике лабораторий ускоренное определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам и другим химиотерапевтическим препаратам осуществляется некоторыми зарубежными автоматизированными системами микробиологических исследований (MS-2, Qantum 2, Sceptor и др.). В кюветах панели содержатся дегидрированные субстраты или диски с антибиотиками. Каждый антибиотик в кювете представлен в одной концентрации, соответствующей критерию принадлежности бактерий к группе " чувствительных" к антибиотику. Одновременно тестируется 20 и более антибиотиков. После внесения взвеси испытуемых бактерий посевы инкубируют при 35-37°С в течение 4-5 ч. Результаты регистрируют спектрофотометрически или кондуктометрически сразу при появлении размножения бактерий в контроле без антибиотика.

Для ускоренного определения чувствительности или устойчивости бактерий к бета-лактамным антибиотикам широко используются различные методы выявления бета-лактамазной активности бактерий. Представляем один из методов определения бета-лактамазы бактерий (Сиволодский Е.П., 1980). На фильтровальную бумагу (2х2 см) в чашке Петри наносят одну каплю 2% раствора водорастворимого крахмала. После ее впитывания наносят петлей в центр бумаги агаровую культуру испытуемых бактерий (например, стафилококков) и растирают в виде бляшки диаметром 3-4 мм. На поверхность бляшки наносят одну каплю (0, 05 мл) рабочего йодного раствора бензил-пенициллина. После экспозиции 10 мин при комнатной температуре учитывают результаты реакции. Наличие бета-лактамазы: на темно-синем фоне четкая зона полного просветления вокруг бляшек бактерий. Отсутствие бета-лактамазы: на темно-синем фоне нет зоны просветления вокруг бляшки, края бляшки нечеткие, сливаются с фоном. Наличие бета-лактамазы указывает на устойчивость бактерий к антибиотику.

Реактивы на бета-лактамазу: реактив №1 - 0, 005-молярный раствор йода (йод -1, 27 мг/мл, калия йодид -15 мг/мл; 1/15 -молярный фосфатный буфер рН 6, 5 до необходимого объема); реактив №2 - 2% раствор водорастворимого крахмала; реактив №3 - рабочий йодный раствор бензилпенициллина (во флакон, содержащий 500 000 ED бензилпенициллина, вносят 10 мл реактива № 1), годен в течение 2 ч.

Методом определения ESBL-продуцирующих штаммов. Поскольку при тестировании таких штаммов значения МПК цефалоспоринов III-IV поколений не всегда достигают уровня резистентности (8-16 мл), возникает необходимость использования специальных методов диагностики ESBL [3]. Применяемые с этой целью фенотипические тесты основаны на эффекте подавления активности ESBL в отношении оксиимино-β -лактамов в присутствии клавулановой кислоты.

Метод «двойных дисков» представляет вариант классического дискодиффузионного метода определения чувствительности, который позволяет обнаружить продукцию ESBL по наличию расширенной зоны подавления роста вокруг диска с цефалоспорином III поколения, например цефтазидимом, расположенного на расстоянии 20-30 мм от диска, содержащего клавулановую кислоту, обычно в виде комбинации амоксициллин/клавуланат (рис. 3).

Известные модификации данного метода, повышающие эффективность детектирования ESBL, включают использование дисков с различными оксиимино-β -лактамами, а также их размещение на разном удалении от диска, содержащего ингибитор.

Прямое сравнение уровней устойчивости к цефалоспоринам расширенного спектра и их комбинациям с клавулановой кислотой, используемое в ряде коммерчески доступных диагностических систем, обеспечивает более объективную оценку продукции ESBL.

Рис. 3. Использование метода «двойных дисков для выявления продукции ESBL: А - отрицательный результат, Б - положительный результат. Обозначения дисков: АМС - амоксициллип/клавулановая кислота (20/10 мкг), CAZ - цефтазидим (30 мкг), СТХ - цефотаксим (30 мкг)

СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ И СРЕДСТВА БЫСТРОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ОПАСНЫХ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ К АНТИБИОТИКАМ И ХИМИОПРЕПАРАТАМ.

Информация о чувствительности инфекционного агента к антимикробным препаратам должна быть получена в наиболее короткие сроки.

Все существующие методы – классические (метод серийных разведений, диско-диффузионный и другие) и ускоренные (цитоморфологический, индикаторный) – не соответствуют требованиям лечебной и эпидемиологической практики из-за длительных сроков получения результатов исследования, что связано с необходимостью выделения чистой культуры возбудителя. Для противоэпидемиологической защиты большой интерес представляют методы экспресс-анализа, позволяющие установить антибиотикограмму возбудителя непосредственно в нативном материале или в первичном посеве, т.е. без выделения чистой культуры, что сокращает время анализа на несколько часов.

В настоящее время разработано и испытано несколько модификаций экспрессного метода определения чувствительности возбудителей ОИЗ к антибиотикам в первичном посеве исследуемого материала с помощью иммунологических реакций. Речь идет о применении метода флюоресцирующих антител, реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) иммуно-ферментном анализе (ИФА). Основу модификаций экспрессного анализа антибиотикочувствительности составляет регистрация с помощью специфических антител действия препаратов на рост и размножение популяции возбудителей в смешанной культуре, т.е. в ассоциации с сопутствующей микрофлорой.

Различными авторами показано, что иммунофлюоресцирующая методика экспресс-определения антибиотикочувствительности позволяет устанавливать при первичном посеве материала антибиотикограмму возбудителей холеры, чумы, сибирской язвы и мелиоидоза через 8-12 часов, сапа, туляремии и бруцеллеза – через 18-24 часа. Необходимыми условиями анализа являются: содержание в 1мл материала не менее 5х10⁵-10⁷ микробных клеток и до 4х10⁴ – сопутствующей микрофлоры, использование специальных питательных сред, соблюдение температурных режимов инкубации посевов. Результаты анализов оценивали с помощью иммунофлюоресцирующей микроскопии по шкале, разработанной на основе функции желательности в зависимости от процента ингибиции микробного роста.

Более удобным методическим приемом экспресс-анализа антибиотикочувствительности возбудителей ОИЗ оказалась РНГА. Так, по данным Л.Н. Ферстнер и соавт., В.Н. Метлина и соавт., для анализа с использованием РНГА минимальное содержание возбудителя в пробе должно быть не менее 2х10⁵ микробных клеток в 1мл, время инкубации посевов в зависимости от вида бактерий составляло 10, 12, 22 часа. О действии антибактериальных препаратов судили по не менее чем четырехкратному снижению титра антигенов соответствующего возбудителя в опытных (с определенной концентрацией антибиотиков) посевах по сравнению с контрольными (без антибиотика). Примерно такие же условия и сроки проведения анализа получены и при использовании иммуноферментного твердофазного метода. Несомненными достоинствами экспресс-анализа являются простота его выполнения и доступность практическим лабораториям. Организовано производственное изготовление необходимых диагностических препаратов: специфических люминисцирующих сывороток, антительных эритроцитарных диагностикумов, тест-систем для ИФА.

Однако, результаты экспресс-анализа носят ориентировочный характер. Поэтому предлагается двухэтапная схема определения чувствительности возбудителей ОИЗ к антибактериальным препаратам. На первом этапе нативный материал, в котором методами специфической индикации и идентификации обнаружен возбудитель, исследуют на антибиотикочувствительность с помощью флюоресцирующих антител, РНГА и др. Результаты анализа, полученные на первом этапе, служат основанием для предварительного выбора средств специфической экстренной профилактики или этиотропного лечения в очагах ОИЗ.

На втором этапе устанавливают антибиотикограмму выделенных чистых культур возбудителей. Это исследование проводят классическими методами: диско-диффузионным или методом серийных разведений. Сроки получения результатов указанными методами составляют от 18-20 до 48-72 часов (в зависимости от вида микроорганизмов), не считая времени, необходимого для выделения и идентификации чистой культуры возбудителя болезни. Результаты исследования используют для подтверждения или корректировки данных, полученных на первом этапе.

Для унификации и стандартизации процесса исследования были усовершенствованы технологические средства, предназначенные для определения антибиотикочувствительности возбудителей ОИЗ классическими методами. Речь идет о разработке питательных сред «Унимикон-ч», приготавливаемых на основе ферментолизата белков непищевого назначения, специально предназначенных для определения чувствительности возбудителей инфекций всеми методами не только к антибиотикам, но и к сульфаниламидам. Была разработана серия тест-систем, в том числе и тест-система «МПК-тест ОИЗ», содержащих лиофилизированную питательную среду с различными концентрациями антибиотиков всех классов, обеспечивших ускоренное определение всех классов бактерий к антимикробным препаратам методом серийных разведений. Сроки анализа при работе с чистыми культурами сибиреязвенных бацилл составляли 10 часов, возбудителей чумы – 16 часов, туляремии и бруцеллеза – 20-24 часа.

Большую ценность для практики представляет собой интерпретационная таблица полуколичественного учета результатов определения чувствительности к антибиотикам возбудителей ОИЗ диско-диффузионным методом. С помощью таблицы по величине зон подавления роста бактерий вокруг стандартных дисков с антибиотиками можно рассчитать величину МПК в отношении быстро- и медленнорастущих возбудителей ОИЗ.

Анализ современных информационных материалов позволяет определить следующие основные направления разработки и дальнейшего совершенствования методических приемов и средств, предназначенных для быстрого установления чувствительности патогенных микроорганизмов к антибактериальным препаратам. Это, прежде всего, создание принципиально нового метода экспрессного определения лекарственной устойчивости микробов, основанного на использовании реакции ДНК – ДНК-гибридизации.

Принцип метода заключается в применении ДНК-зондов, выявляющих у микробов генетические детерминанты, кодирующих плазмидную или хромосомную резистентность микробной популяции к определенным видам или группам антибиотиков. Метод не требует выделения чистой культуры и подращивания материала на питательных средах, содержащих антибиотики, что значительно сокращает сроки исследования.

Чувствительность реакции ДНК-гибридизации может быть значительно повышена с помощью ПЦР: в короткие сроки можно синтезировать из одного ДНК фрагмента свыше 10 его копий. Благодаря высокой специфичности и чувствительности сочетанного применения ПЦР и метода молекулярной гибридизации обеспечивается возможность получения результатов в течение 6-8 часов от начала анализа нативного материала, что, безусловно, привлекает внимание специалистов к этому способу. Однако, сложность применения этой тест-системы пока не позволяет «вывести» ее за пределы научно-исследовательских лабораторий.

Второе направление исследований по проблеме определения антибиотикочувствительности патогенных микробов – разработка и внедрение в лабораторную практику технических средств, позволяющих автоматизировать процесс регистрации подавления микробного роста антибактериальными препаратами. За рубежом различными фирмами выпускаются приборы-автоматы, быстро обеспечивающие стандартность исследования и получение антибиотикограммы. Такие приборы-автоматы, как MS-2, Autobac, используются во многих научно-исследовательских и многих практических лабораториях медицинских учреждений России. Разработан отечественный прибор ПЧА-1 для определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам, с помощью которых результат выдается после инкубации пробы в течение 2-3 часов. В целях практического решения рассматриваемой проблемы целесообразно организовать производственный выпуск дисков, содержащих современные антибиотики и химиопрепараты, и стандартных питательных сред для определения чувствительности микробов не только к антибиотикам, но и к химиопрепаратам, а также тест-систем, в состав которых вошли бы питательные среды с различными концентрациями всех антимикробных средств.

Таблица. Основные антибиотики.