Бактерій до аміноглікозидів

В связи с широким распространением в клинической практике ферментативной устойчивости микроорганизмов к аминогликозидам большое значение приобретают методы, позволяющие быстро обнаружить и охарактеризовать активность ферментов. В настоящее время известны следующие методы определения активности АГМФ.

1. Метод радиохимического связывания определенного набора подвергнутых ферментативной модификации аминогликозидов с фосфоцеллюлозной бумагой [10]. В процессе ферментативной модификации в качестве ко-факторов используют АТФ, меченную радиактивным фосфором или углеродом, или ацетил-коА, меченный углеродом [11]. По количеству включенной метки оценивают удельную активность фермента в отношении того или иного аминогликозида.

2. ДНК–ДНК гибридизация для выявления генов резистентности к аминогликозидам проводится с использованием лизированной чистой культуры, фиксированной на нитроцеллюлозных фильтрах [11] [12] [13]. Метод основан на использовании " зондов", представляющих собой меченые денатурированные молекулы ДНК разного размера, гомологичные генам аминогликозидрезистентности. Метод используется в эпидемиологических исследованиях [4], а также при определении генов резистентности микроорганизмов непосредственно в клиническом образце [2].

3. Метод, основанный на соответствии фенотипа устойчивости бактерий к определенному набору аминогликозидов типам продуцируемых АГМФ.

Первый вариант этого метода основан на оценке значений минимальной подавляющей концентрации (МПК) для 6 аминогликозидов (неомицин, канамицин, гентамицин, сизомицин, тобрамицин и амикацин). Он позволяет определить ферменты АРН(3'), ААС(3)-I или ААС(3)-II, АNT(2''), а также их комбинации.

В т о р а я разновидность метода под названием метод AGRP (aminoglycoside resistance patterns) предполагает использование 12 аминогликозидов: канамицина, неомицина, гентамицина, тобрамицина, амикацина, нетилмицина, 2'-N-этилнетилмицина, 6'-N-этилнетилмицина, исепамицина, 5-эписизомицина, фортимицина и апрамицина [27]. В этом случае или определяют МПК аминогликозидов методом микроразведений в бульоне или агаре, не обогащенных катионами, или измеряют диаметры зон подавления роста при исследовании дискодиффузионным методом. Метод не позволяет определять ферменты, инактивирующие стрептомицин.

4. Определение АГМФ с помощью идентификации продуктов их инактивации методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) [4]. Метод позволяет идентифицировать фосфотрансферазы АРН(3'), АРН(2''), а также ацетилтрансферазы ААС(2'), ААС(3) и ААС(6') при одновременном присутствии их в неочищенных бесклеточных экстрактах. Идентификация осуществляется по предварительно рассчитанному (для известных инактивированных продуктов) времени удерживания исследуемого вещества на хроматографической колонке.

5. Анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов плазмидной ДНК, кодирующей АГМФ[4]. Метод предусматривает расщепление плазмидной ДНК, выделенной из штаммов бактерий, с помощью рестрикционных эндонуклеаз и разделение продуктов рестрикции путем электрофореза в агарозном геле. Метод не позволяет точно идентифицировать АГМФ, но может использоваться в эпидемиологических исследованиях.

Наиболее распространенными методами типирования АГМФ являются методы ДНК–ДНК гибридизации и AGRP. Сравнивая эти методы, следует отметить, что каждый из них имеет определенные преимущества. ДНК–ДНК гибридизация является надежным методом определения наличия генов и позволяет выявить " молчащие" гены, которые невозможно определить методом AGRP, а также присутствие в штаммах нескольких генов с перекрывающимися спектрами антибиотикорезистентности.

Метод AGRP также является надежным методом определения типов АГМФ при условии, что штаммы не содержат генов с полностью перекрывающимися спектрами антибиотикорезистентности. В отличие от ДНК–ДНК гибридизации метод AGRP позволяет выявлять штаммы, у которых резистентность к аминогликозидным антибиотикам обусловлена не только продукцией АГМФ, но и нарушением проницаемости клеточной стенки. Другим преимуществом метода AGRP является возможность выявления генов резистентности к аминогликозидным антибиотикам, имеющих высокую степень гомологии ДНК (то есть идентичных по результатам ДНК–ДНК гибридизации), но различающихся по спектру резистентности к аминогликозидам из за наличия в них незначительных мутационных изменений.

При определении АГМФ этими двумя методами частота несовпадения результатов для основных клинически значимых ферментов составила меньше 3% [33].

Исходя из сказанного логично заключить, что для характеристики резистентности к аминогликозидам грамотрицательных микроорганизмов и стафилококков в клинической практике целесообразно использовать оба метода, AGRP и ДНК–ДНК гибридизации, позволяющие получать взаимодополняющие результаты [33].