Мезельсон мен Сталь тәжірибесі. ДНК-полимеразалар мен олардың қасиеттері. Үздікті және үздіксіз ДНҚ синтезі. Оказаки фрагменттері.

• Мезельсон мен Ф.Стальдің (1958) тә жірибе-і ү лгі бойынша жасалғ ан болжам-ғ а сә йкес ДНҚ репликациясы жартылай консервативті жолмен жү ретіндігін кө рсетті. ДНҚ -ың ә р жаң а молекуласы ата-анасының қ ос тізбекті спиралінен берілген бір ескі тізбектен жә не бір жаң а тү зілген тізбектен тұ рады.

Олар E.coli клетка-ын азотты ортада ө сірген. Азоттың бұ л ауыр изотопы ДНҚ қ ұ рамына еніп таң ба қ ызметін атқ арғ ан. Бактериялар ә рбір 20 минут сайын жаң а ұ рпақ беріп отырады. Ө сіру кезінде бактерия-ың бірн. Ұ рпақ -ы генерация алмасқ ан, соң ында барлық клет-ың ДНҚ -да азоттың ауыр 15N-изотопы болғ ан. Содан соң бактериялар азоттың жең іл изотопы 14N бар қ оректік ортағ а ауыстырылғ ан. ДНҚ репликациясы мен клетканың бө лінуінен кейін бірн. Уақ ыт ө ткеннен соң клетка-ың жаң а генерация-ың ү лгі-і таң далып алынып, о-ғ ы 15N мен14N изотоп-ың таралу мө лшері анық талғ ан. Екеуін бір-бірінен тығ ыздығ ына қ арап ажыратуғ а болады. Себебі 15N бар ДНҚ -ғ ы бір нуклеотидтің салмағ ы кә дімгі ДНҚ -ғ а қ арағ анда артығ ырақ болады. Центрифугалау барысында ДНҚ молек-ы ерітіндінің тығ ыздығ ы олардың ө з тығ ыздығ ына сай келетін қ абатына жинақ талады. 15N бар ортада ө сірілген E.coli клет-ғ ы ДНҚ -ың тығ ыздығ ы 1, 724 г/см3 болса, кә дімгі 14N ортада ө сірілген клетка-ғ ы ДНҚ -ың тығ ыздығ ы 1, 710 г/см3 болғ ан.

14N ортада ө сірілген бірінші бө лінуден кейін клетка культурасының тығ ыздығ ы 15N-ДНҚ мен 14N –ДНҚ -ың аралығ ында болады. Екінші бө лінуден кейін 14N ортада ө сірілген клетка-ың жартысы 14N –ДНҚ, ал екінші жартысы аралық тығ ыздық болады. Ү шінші бө лінуден соң 14N ортада ДНҚ -ың ¾ бө лігі 14N ДНҚ -ың тығ ыздығ ына тең болады, ал ¼ бө лігі аралық тығ ыздық ты сақ тады.Генерациялар саны мен ДНҚ тығ ыздығ ының арақ атынасы репликацияның жартылай консервативті типіне сә йкес келген.

Дисперсивті репликация болғ ан жағ дайда, t=0-ден кейін барлық ДНҚ аралық тығ ыздық та болып, қ ұ рамында 14N –пен таң баланғ ан ДНҚ -сы бар сызық қ а біртіндеп жақ ындай отыра, ә р клетка бө лінуінен кейін арылық тығ ыздық сызығ ы жең ілдене тү сер еді. Мұ ндай кө рініс байқ алмағ андық тан, дисперсивті репликация тә жірибе жү зінде дә лелденбеген болып есептеледі.

• 1957 ж. Артур Корнберг тұ ң ғ ыш рет E.coli бактерия-да нуклеотидтерден ДНҚ -ның полимерлену процесін катализдейтін фермент – ДНҚ -полимеразаны ашты. Ол осы ферменттің белсенділігін клеткасыз ортада зерттеп, ДНҚ -полимераза қ атысуымен ДНҚ синтезінің қ ажетті екі шартын анық тады:

1. Барлық 4 дезоксирибонуклеозидү шфосфат-ың болуы (dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dNTP)

2. ДНҚ -матрицаның болуы.

Жартылай конс-і репликацияда ДНҚ -полимераза белсенділігі ДНҚ -матрицағ а да тә уелді болып келеді. Бқ л фермент бір уақ ытта органикалық емес пирофосфатты босатып шығ арумен бірге ДНҚ тізбегінің ұ шына дезоксирибонуклеотидті қ алдық -ың тізбектеліп байланысуын катализдейді:

ДНҚ полим-а 928 аминқ ышқ ылынан тұ ратын полипептид. Оның жұ мысы ү шін Mg ион-ы қ ажет, ал оның активті орталығ ында ферментпен берік байланысқ ан Zn2+ ионы болады. E.coli клет-ы І, ІІ, ІІІ деп белгіленетін ДНҚ -полим-ың ү ш тү рін қ амтиды. Оның ішінде кең тарағ аны – ДНҚ полим-а І. ДНҚ полим-ар – бұ л молек.салмағ ы 100000 дальтоннан артық болатын ірі белоктар. Олар 3’-5’ экзонуклеазалы белсенділігі де болады. Бұ л фермент белгілі бір қ ателік кеткенде жә не қ ұ рылып жатқ ан тізбекке «теріс» нуклеотид барып қ осылғ анда ғ ана жұ мысқ а кіріседі. ДНҚ полим-а ІІІ (холофермент) ДНҚ полим І сияқ ты праймер тізбектің 3-ұ шына жаң а нуклеотидтер қ осу арқ ылы 5-3 бағ ытында ДНҚ -ны ұ зартады.

• ДНҚ синтезінің ү зікті синтезін алғ аш рет жапондық ғ алымдар Рейдзи Оказаки мен Тунеко Оказаки дә лелдеген. Олар ішек таяқ шасының клетка-да бактериофаг ДНҚ -ың репликациясы кезінде жаң а синтезделген ДНҚ -ың кей реттілік-і 1000-2000 нуклеотидті фрагменттер тү рінде болатынын анық тағ ан. Осындай ә р фрагменттің қ ұ рамына РНҚ -праймер кіреді. Бұ л фрагмент-ді Оказаки фрагме-і д.а. Синтез процесінде осы фрагменттер ұ зарып, молекулалық салмағ ы жоғ ары фрагмент-ге айналады.

Бастаушы жә не қ алып қ оятын тізбек-ің синтезін ә р тү рлі полимеразалар жү зеге асрады. Оказаки фрагмеенті синтезінің басталуына қ ажетті бос кү йіндегі 3-ұ шы РНҚ праймер немесе РНҚ -ашытқ ы д.а-ын РНҚ -праймаза ферментінің кө мегімен синтезделетін РНҚ -ың қ ысқ а жіпшесімен қ амтамасыз етіледі. Праймаза ферменті хеликаза жә не ДНҚ -мен байланысып праймосома д.а-ын қ ұ рылымды қ алыптастырады жә не РНҚ -праймерді синтездейді.

РНҚ -праймерлер ДНҚ -ың матрицалық жіпшесіндегі бірнеше бө лімше-мен бірдн комплементарлы тү рде жұ птаса алады, сө йтіп ДНҚ -полим-а ІІІ ферментінің қ атысуында бірден бірнеше Оказаки фрагмент-ің синтезделуіне мү мкіндік туғ ызды, ол кейін матрицалық тізбекке комплементарлы жаң а ДНҚ тізбегін синтездейді. Синтезделген Оказаки фрагменті кезекті РНҚ -праймердің 5-ұ шына жеткен кезде ДНҚ -полимераза І ферментінің 5-экзонуклеазды белсенділігі байқ ала бастайды, ал ол бірте-бірте 5-3 бағ ытында РНҚ нуклеотид-ін босатып шығ арады. Бұ л жағ дайда шығ арылып тасталатын РНҚ -праймер ДНҚ -ың тиісті фрагмент-мен алмастырылады.

ДНҚ -ың п.б-ан «жарт. консервативті» бө лімінің ары қ арай спиральдануы ДНҚ -гиразаның жә не кей басқ а белок-ың қ атысында жү реді. Праймаза-хеликаза комплексінің жаң а РНҚ -праймер-ді синтездей отырып, репликацияның айырылымымен бірге жылжитындығ ы анық талғ ан. Праймер Оказаки фрагментінің синтезі барысында SSB-белок-ын ығ ыстырып шығ аратын РНҚ -полим-а ІІІ ә сері есебінен ұ зарады.

ДНҚ полим ІІІ қ алып қ оятын тізбекте айрылымымен жылжи отырып жаң адан қ олданыс тауып отырады. Сө йтіп, ДНҚ екі матрицалық тізбекте де жоғ ары дең гейде синтезделеді. Репликация терминациясы ү шін терминация бө лім-ін н/е ter-сайттарды сезетін tus генінің ө нім-і қ ажет.