Мезольсон мен Сталь тәжірибесі. ДНК – полимеразалар мен олардың қасиеттері. Үздікті және үздіксіз.

М.Мезельсон мен Ф.Стальдың (1958) тә жірибелері ү лгі бойынша жасалғ ан болжамдарғ а сә йкес репликациясы жартылай кнсервативті жолмен жү рретіндігі кө рсетті. ДНҚ -ның ә рбір жаң а молекуласы ата-анасының қ ос тізбекті спиралінен берілген бір ескі тізбектен жә не бір жаң а тү зілген тізбектен тұ рады. Олар E.coli клеткаларын азотты N15 ортада ө сірген. Азоттың бұ л ауыр изотопы ДНҚ қ ұ рамына еніп таң ба қ ызметін атқ арғ ан. Бактериялар ә рбір 20 минут сайын жаң а ұ рпақ беріп отырады. Ө сіру кезінде бактериялардың бірнеше ұ рпақ тары генерация алмасқ ан, соң ында барлық клеткалардың ДНҚ - сында азоттың N15 изотопы болғ ан. Содан соң бактериялар азоттың жең іл изотопы N14 бар қ оректік ортағ а ауыстыырлғ ан. ДНҚ репликациясы мен клетканың бө лінуінен кейін бірнеше уақ ыт ө ткеннен кейін бірнеше уақ ыт ө ткеннен соң клеткалардың жаң а генарцияларың ү лгілері таң далынып алынып, олардағ ы N 15 мен N14 изотоптарының таралу мө лшері анық талғ ан. N15 изотопы бар молекулалары жең іл N14 изотопы бар молекулалардан тығ ыздығ ына қ арап ажыратуғ а болады. Себебі N15 бар ДНҚ -дағ ы бір нуклеотидтің салмағ ы кә дімгі ДНҚ -ғ а қ арағ анда артығ ырақ болады. Тығ ыздығ ы ә ртү рлі молекулаларды хлорлы цезий градиентінде центрифугалау арқ ылы бө ліп алуғ а болады. Центрифугалау барысында ДНҚ молекулалары ерітіндінің тығ ыздығ ы олардың ө з тығ ыздығ ына сай келетін қ абабтына жинақ талады.N15 бар ортада ө сірілген E.coli клеткаларындағ ы ДНҚ -ның тығ ыздығ ы 1, 724 г/см3 болса, кә дімгі N14 ортада ө сірілген клеткалардағ ы ДНҚ -ның тығ ыздығ ы 1, 710г/см3 болғ ан.N14 oртада ө сірілген бірінші бө лінуден кейінгі клетка культурасының тығ ыздығ ы N15 -ДНҚ мен N14 аралығ ында болады.Екінші бө лінуден кейін N14 ортада ө сірілген, клеткалардың жартысы N14, ал екінші жартысы N14 – N15 ДНҚ аралығ ында болады.Ү шінші бө лінуден кейін ДНҚ -ның 3/4 бө лігі N14 ДНҚ -ның тығ ыздығ ына тең болғ ан, ал ¼ бө лігі аралық тығ ыздық ты сақ тады.Генерациялар саны мен ДНҚ тығ ыздығ ының арақ атынасы репликацияның жартылай консервативті типіне сә йкес келеді.

ДНҚ –полимеразалар – бұ л молекулалық салмағ ы 100000 Дальтонннан артық болатын ірі белоктар.Олар 3—5 экзонуклеазды белсенділікке ие: инуклеотидтерді бір бағ ытта жинақ тайдыда, соң ынан байланысқ ан нуклеотидтерді қ иып тастайды. Экзонуклеазды белсенділік дегеніміз реттіліктің дұ рыстығ ын тексеру, яғ ни қ ате жұ птасқ ан нуклеотидтерді жойып, орнын комплементарлы дұ рыс орналасқ ан жұ бына ауыстыру.

ДНК тізбектерінің бағ ытгары қ арама-қ арсы екені белгілі. Жұ мысына ө те мұ қ ият ферменттер жаң а тізбекті тек бір бағ ытта, яғ ни 5'— 3' бағ ытында ғ ана жасайды. Олай болса, ферменттер ажырағ ан тізбектердің біреуінің бойымен жаң а тізбекті жоғ арыдан тө мен қ арай, ал екіншісінің бойымен тө меннен жоғ ары қ арай синтездейді. Ең қ ызығ ы жаң а тізбектер ү здіксіз жасалмайды, ескі тізбектің бойында бірінен кейін бірі шағ ын ДНҚ фрагменттері пайда болып отырады. Ондай фрагменттердң ұ зындығ ы қ арапайым бактерияларда 200 нуклеотидтен тұ рса, кү рделі организмдерде ол 2000-ғ а жуык. Осындай фрагменттерді алғ аш байқ ағ ан жапон ғ алымы Р. Оказаки, сондық тан оларды оказаки фрагменттері деп атайды. Тізбектердің ажырауы мен қ осылуы ферменттердің ық палымен жү реді. Ажырағ ан тізбектерде оказаки фрагменттері жасала бастайды. Ә р фрагмент он шақ ты нуклеотидтен тұ ратын РНК, тізбегінен басталады. ДНҚ тізбегінің бойымен РНҚ тү ріндегі жаң а тізбекті праймаза (РНК, — полимераза) ферменті ғ ана бастай алады. Тізбекті бастағ ан РНҚ бө лшегінен ары қ арай " ДНҚ — полимераза — 3" деген фермент ажырағ ан ДНҚ бө лігіне сә йкес етіп оказаки фрагментін синтездейді. Содан кейін басқ а " ДНҚ полимераза — 1" ферменті фрагменттердің бастаушысы болғ ан ә лгі РНК, тізбегін ыдыратып жібереді. Енді кезек " ДНК-лигаза" деген ферментке келеді, Ол оказаки фрагменттерінің арасын ескі ажырағ ан тізбекке сә йкес етіп нуклеотидтермен толтырады. Ең соң ында " ДНК полимераза - 2" ферменті кө птегсн фрагменттердің бірігуінен пайда болғ ан жаң а тізбектің ң уклеотидтерінің ескі тізбегімен сә йкес келетіндігін тексереді. Егер қ андай да бір нуклеотид ө з орнында тұ рмаса соң ғ ы аталғ ан фермент оны кесіп алып тастап, оның орнына тиісті нуклеотидті қ ояды. Осындай ә р тү рлі қ ызмет аткаратын ферменттердін ү йлесімді жұ мыс жасауы тұ қ ымдық, белгіні ДНК арқ ылы-синтездей алады, ө иткені матрицалық тізбектің соң ы бос 3'— ОН тобынан басталғ ан, дә л осы соң ғ ы бө лікке ғ ана ө сетін ДНҚ тізбегінің келесі нуклеотиді комплементарлық ережеге сә йкес қ осыла алады. Бұ л тізбектің сннтезделуі, екінші тізбекке қ араганда сә л ерте басталады, сол себепті ол «бастаушы» тізбек деп аталады.

ДНҚ -ның екінші 5'—► 3' бағ ытындағ ы тізбектің («артта қ алғ ан») синтезделуі ү зілмелі тү рде жү реді, Бұ л тізбекті ДНҚ -полимераза III ферменті бірден ө здігінен синтездей алмайды. «Артта қ алган» тізбек синтезін қ оздыру ү шін ен; алдымен РНҚ -ныц қ ысқ а фрагменті (ұ зыпдығ ы 50 нуклеотидке дейін) қ ажет. Бұ л қ ысқ а кесінді праймер (немесе қ оздырыш) деп аталады, олардың синтезделуі праймаза ферменті (РНҚ -полимераза ферментшен ө згсшелігі — иолекулальиқ массасы ә лдеқ айда тө мен жә не транскрипция процесіне тікелей қ атынаспайды) қ амтамасыз етеді. Праймердің 3'—• ОН — ұ шы ДНҚ -полимераза III ферментіне ДНҚ -ның 5'—> 3' бағ ытындағ ы тізбегінің синтезделуін бастау ү шін қ оздырушы болып табылады.

49-сұ рақ.Эукариоттық жә не прокариоттық клеткалардағ ы экспрессиясының ұ йымдасуы мен реттелуіндегі ерекшеліктері.

Прокариотты гендер экспрессиясы: E.coli бактериялары кө міртегі мен энергияның бірден-бір кө зі ретінде лактозаны пайдалануы мү мкін, себебі олар лактоза дисахаридін галактоза мен глюкозағ а дейін ыдырататын фермент бета-галаксидазаны кө п мө лшерде тү зе алуғ а қ абілетті. Франция ғ алымдары Жакоб пен Моно қ ұ рылымдық гендер жұ мысының ү йлесімді бақ ылануын реттейтін моделін – оперон моделін ұ сынды. Бір-бірімен тығ ыз байланысқ ан қ ұ рылымдық гендер, оператор жә не промотордан тұ ратын, ү йлесімді тү рде экспрессияланатын гендер тобын – оперон деп атайды. Лактозалық оперонның қ ызметі мынандай жолмен жү реді lacZ, lacY жә не lacA гендерінің транскрипциясы lacІ генімен кодталатын белок репрессорымен бақ ыланады. Lacоперон лактоза қ антының қ атысуымен жү ретін ү ш тү рлі геннен тұ рады:

1.бета-галактозидаза(lacZ) – лактозаны глюкоза мен галактозағ а ыдыратады.

2.галактозидпермеаза(lacY) – клеткағ а лактозамен қ оса қ анттарды тасымалдауды қ амтамасыз етеді.

3.бета-галактозид трансацетилаза(lacA) – ол фермент ацетильды топты ацетил коэнзим А-дан бета-галактозидке алып барады, сө йтіп бактерияның ө суіне жағ дай жасайды.

Оперон моделі бойынша, қ ызметі жағ ынан бір-бірімен тығ ыз байланысты, полипептидтерді кодтаушы қ ұ рылымдық гендер тобының транскрипциясы екі бақ ылаушы элементтер – реттеуші-ген жә не оператор арқ ылы реттеледі.

Лактоза қ оректік ортада болмаса репрессор белок ү немі синтезделеді. Ол операторлық сайтқ а отырып, промоторғ а РНК-полимеразаның байланысуына жол бермейді. Репрессор белок промоторлық сайтты блоктап, РНК-полимеразаның жұ мысын бастауғ а кедергі келтіреді.

Лактоза болғ ан жағ дайда аллолактоза деген кіші молекулалы қ ант бактерия ішінде тү зіледі. Ол репрессор белогының арнайы сайтымен байланысып, оның конформациялық пішінін ө згертеді. Бұ л ө з кезегінде репрессор белоктың формасын ө згертуге ә келеді. Ө згерген репрессор белок операторылқ аймақ қ а отыра алмайды. Нә тижесінде РНК-полимераза промоторғ а отырады. Транскрипция жү реді. Lacоперон тек лактоза болғ анда ғ ана жү зеге асады. Бірақ қ оректік ортада лактоза да глюкоза да болғ анда транскрипция жү рмейді.

Ал эукариоттардың ерекшеліктері:

прокариоттық клеткаларғ а қ арағ анда эук.клеткалар қ ұ рамында ДНҚ мө лшері жоғ ары.

Эукариоттардағ ы транскрипция процесі трансляция процесінен уақ ыт бойынша да, кең істік бойынша да ажыратылып бө лінген. Бірінші болып ядрода транскрипция жү реді, артынан цитоплазмада мРНК-ның трансляциясы жү реді. Прокариоттарда РНК синтезі де жә не белок синтезі де цитоплазмада жү реді жә не транскрипция толық аяқ талмай тұ рып трансляция бастала береді.

Эукариоттар гендерінің транскриптілері цитоплазмағ а тасымалданудан бұ рын жетіліп қ ысқ арады.

Эукариоттардағ ы ген экспрессиясы қ оршағ ан орта факторлары ә серінен, жоғ ары температура, сигналдық молекулалар – гормондар, ө су факторлары арқ ылы туындалуы мү мкін.

Эукариоттар стериодты немесе пептидті гормондар арқ ылы реттелуі мү мкін.

Эукариоттар генінің транскрипциясы белок пен ДНК сиквенсі арасында жатқ ан гендер арқ ылы реттеледі.

50-сұ рақ. Сплайсинг қ ұ былысын тү сіндірің із.Альтернативті сплайсинг.

Сплайсинг процесінде, яғ ни РНК реттілігінің біршама бө лігі алып тасталынып, қ алғ ан фрагменттер бір-бірімен байланысқ ан кезде гяРНК-ның шамамен 25пайызы мРНК-ғ а айналып, трансляцияғ а дайын мРНК тү зеді. Сплайсинг арнайы ферменттер қ атысында, немесе кейбір жағ дайда интрондар қ ұ рамында белгілі жерде ыдырауын катализдейтін ерекше нуклеотидтер реттілігі болғ ан кезде ө здігінен жү реді. Мұ нда РНК молекуласы рибонуклеотидті тізбекті ыдырататын катализатор ретінде, яғ ни фермент қ ызметін атқ аруы мү мкін. РНК-дан қ ұ рылғ ан осындай ферменттер рибозимдер деп аталады. Рибозимдер қ атысында интрондардың ө здігінен кесіліп, ыдырау процесіне кофактор ретінде гуанозин қ ажет.

Сплайсинг ядрода кіші ядролық рибонуклеопротеиндердің бө лшектерімен байланысқ ан пре-мРНК-дан тұ ратын сплайсосомдар деп аталатын ерекше қ ұ рылымдарда жү реді. U1-U6 деп аталатын алты кяРНК молекулалары пре-мРНК-дан интрондардың дұ рыс кесіліп алынуын қ амтамасыз етеді. Жетілмеген бастапқ ы ядролық мРНК-да интрондардың ұ зындығ ы 20000 нуклеотидке дейін жетеді, сондық тан олар ө здігінен алып тасталынбайды, олардың ыдырауын қ амтамасыз ететін кү рделі механизм қ ажет. Пре-мРНК-да сплайсинг екі кяРНКлардың интронның басы жә не соң ғ ы ұ шымен ә рекеттесуінен басталады.

Альтернативті сплайсинг

Пре-мРНК процессингі гендер экспрессиясында реттеуші роль атқ арады. Мысалы, пре-мРНК молекуласында кейбір интрондар бір генге жатады, бірақ оларда ә р тү рлі жолмен сплайсинг процесі жү руі мү мкін. Бұ л экзондар қ ұ рамы бойынша ә р тү рлі мРНК-ның тү зілуіне ә келеді. Мұ ндай альтернативті сплайсинг мРНК-ғ а тә н, олардың трансляциясы кезінде туыс белоктар немесе дрозофила мен адам организмінде болатыны анық талды.