Главная страница Случайная страница
Разделы сайта
АвтомобилиАстрономияБиологияГеографияДом и садДругие языкиДругоеИнформатикаИсторияКультураЛитератураЛогикаМатематикаМедицинаМеталлургияМеханикаОбразованиеОхрана трудаПедагогикаПолитикаПравоПсихологияРелигияРиторикаСоциологияСпортСтроительствоТехнологияТуризмФизикаФилософияФинансыХимияЧерчениеЭкологияЭкономикаЭлектроника
Использование антител
|
|
Антитела использовались на протяжении десятилетий как средство исследования, но в последние годы развитие технологий производства антител сделало возможным их применение во множестве новых областей. Основа всех иммунологических технологий - необычайная специфичность связывания антител и антигенов. Вот несколько примеров:
Иммуноокрашивание это способ локализации антигенов в органеллах, клетках, тканях, отдельных организмах и также способ отличить одну клетку от другой. Например, раковые клетки часто выглядит неотличимо от обычных под микроскопам, но при использовании иммуноокрашивания выявляются существующие различия в количестве и в видах находящихся на поверхности клеток белков (антигенов). Изучение этой информации помогает диагностировать рак и понять свойства раковых клеток.
С помощью иммуноокрашивание тканей или организмов можно узнать в каком типе клеток обычно находится интересующий нас белок, что в свою очередь помогает нам понять функцию этого белка. Например, иммуноокрашивание семян на разных стадиях созревания позволяет нам следить за количеством и расположением молекул белка по мере роста растения. Антитела для иммуноокрашивания конъюгированы с флуоресцентными молекулами, или с ферментами, которые катализируют образование окрашенных веществ.
Специальным приложением иммуноокрашивания является сортировка клеток. При этом процессе популяция клеток окрашивается флуоресцентно меченым антителом и физически разделяется на меченые и немеченые клетки. Клеточный сортер использует лазер для того, чтобы «считать» флуоресцентную метку и электростатический заряд, чтобы разделить клетки в растворе. Он способен разделять до 30 000 клеток в секунду!
Иммуноблоттинг, или вестерн-блоттинг говорит о присутствии белка, его размерах и относительном количестве в данном образце (образец может представлять из себя сложную смесь белков, обычно это лизат клеток). Для осуществления блоттинга, белки, разделенные по размеру в полиакриламидном геле, под действием тока переносятся на нейлоновую или нитроцеллюлозную мембрану. Далее мембрана инкубируется с первичным антителом к интересующему исследователя белку, затем с конъюгированными с ферментом вторичными антителами. Окисляя хромогенный субстрат, фермент образует на мембране окрашенную полосу, или же, фермент может вызывать образование света (хемилюминисцентный субстрат), который вызывает образование засвеченной полосы на фотопленке. Размер белка определяется, сравнивая положение визуализированной полосы с маркерными белками известной массы, прогнанными на том же геле. Количество белка определяется по сравнению интенсивности полосы с интенсивностью маркерных полос.
Одной из модификацией вестерн-блоттинга является дот-блоттинг. При этом образец белка сразу капается на мембрану. Дот-блоттинг используется для быстрого скрининга большого числа образцов. На мембрану может быть одновременно нанесено много образцов, поэтому этот метод позволяет быстро определить, где присутствует определенный белок, но он не предоставляет никакой информации о размере изучаемого белка.
Существует большое количество тест-полосок, или иммунохроматографических тестов. Есть тесты на беременность, на разные наркотики, инфекционные агенты (например на ВИЧ, чуму, E. coli O157: H7 и Legionella), даже на никотин и алкоголь. Эти тесты дают положительный или отрицательный ответ в течение минут. Они основаны на использовании многих антител, одно из которых обычно мечено окрашенным соединением, например коллоидным золотом. Накопление таких антител в определенной зоне вызывает появление там розовой полосы. Например, домашние тесты на беременность детектируют человеческий хорионный гонадотропин (ХГЧ) – гормон, который появляется в крови и моче беременной женщины через несколько дней после оплодотворения. Ближе к нижнему краю на тестовую полоску нанесены мышиные моноклональные антитела к ХГЧ, связанные с розовым коллоидным золотом(шаг 1). После того, как нижний край полоски погружается в мочу, жидкость начинает подниматься наверх под действием капиллярной силы, вместе с ней перемещаются и антитела. Если в моче содержится ХГЧ, он связывается с антителами (шаг 2). Когда комллексы достигают первой тестовой зоны, они связываются с антителами к ХГЧ, фиксированными на полоске, и концентрируются в виде розовой полосы (шаг 3). На полоске всегда есть внутренний контроль в виде фиксированных козьих поликлональных антимышиных антител (узнающих антитела к ХГЧ как связанные, так и не связанные с антигеном) (шаг 4). Таким образом, любой работающий тест дает одну розовую полосу, но только при положительном результате теста можно увидеть две полосы.
Приложение Б: Словарь терминов
3, 3’, 5, 5’-тетраметилбензидин (ТМБ): растворимый колориметрический субстрат, окисляемый пероксидазой хрена в вещество, имеющее синюю окраску. Часто используется в ИФА.
Антиген: любое вещество, которое связывается антителами или Т-клетками и способно вызвать специфический иммунный ответ.
Антитело: белок (иммуноглобулин), синтезирующийся клетками иммунной системы в ответ на столкновение с чужеродным агентом.
Антисыворотка: сыворотка крови, содержащая антитела против определенного антигена
Аутоиммунная болезнь: Болезнь, которая возникает в результате того, что иммунная система атакует клетки своего организма, считая их чужими. Примерами являются системная красная волчанка (эритематоз), ревматоидный артрит и множественный склероз.
Бактериофаг (фаг): вирус, который инфицирует бактерий. Может быть использован для того, чтобы внедрить чужеродную ДНК в бактериальный геном.
Вакцинация: процесс стимулирования образования вторичного иммунитета путем введения непатогенной формы агента, вызывающего болезнь. Слово «вакцинация» происходит от латинского слова vacca – корова- потому что первая проведенная вакцинация это была вакцинация коровьей оспой от оспы человеческой.
Врожденный иммунитет: иммунитет, с которым человек рождается. Включает в себя такие клетки, как циркулирующие макрофаги, которые первыми вступают в контакт с чужеродными агентами. Также называется неадаптивным иммунитетом.
Зооноз: инфекция, передаваемая людям от животных, например бешенство, или атипичная пневмония.
Клон, клонирование: в контексте молекулярной биологии, клонирование – это получение фрагмента ДНК из генома и сшивание его с другой молекулой ДНК, так что теперь эта другая молекула ДНК включает в себя полную копию клонированного фрагмента. В контексте клеточной биологии, «клон» - это группа клеток, произошедшая из одной родительской клетки и несущая идентичную генетическую информацию.
Коньюгат: вещество, образовавшееся в результате ковалентной сшивки двух разных молекул, например, фермента пероксидазы пришитой к антителу.
Генетически модифицированный организм (ГМО): организм, генетический материал которого был направленно изменен с помощью технологии рекомбинантной ДНК.
Иммунная недостаточность: ослабление иммунного ответа, так что иммунная система становится неспособной эффективно защищать организм от болезней. Может быть вызвана генетическими нарушениями, приемом иммуносупрессантов и другими факторами.
Иммуноген: любой агент, вызывающий иммунный ответ. Иммуногены. которые специфично узнаются Б и Т клетками и вызывают специфичный иммунный ответ (приобретенный иммунитет) называются антигенами.
Иммуноглобулин (Ig): общий термин для обозначения антител
Иммунология: изучение иммунной системы, системы органов, защищающей организм от чужеродных веществ, клеток и организмов.
Лигировать: соединить два фрагмента ДНК вместе, например, поместить фрагмент гена, кодирующего антитело, в геном фага.
Лимфоцит: вид белой кровяной клетки. Компонент иммунной системы. Б-лимфоциты созревают в костном мозге, а Т-лимфоциты в тимусе.
Макрофаг: вид белых кровяных клеток. Макрофаги могут окружать и поглощать чужеродные вещества и антигены, этот процесс называется фагоцитозом. У макрофагов есть две основных функции: 1) удаление чужеродных клеток и молекул из крови; 2) переработка (процессинг) антигенов и экспонировании их на своей поверхности.
Микроплашка: пластиковая 96-луночная плашка, предназначенная для ИФА
Оппортунистические инфекции: инфекции, возникающие при ослабленном иммунитете, например кандидоз и туберкулез, развивающиеся у больных СПИДом.
Пассивный иммунитет: приобретение антител из внешнего источника, например, передача с молоком матери или введение антител для лечения болезни (например, при заражении бешенством). Пассивный иммунитет длится только в течение нескольких недель.
Патоген: организм, или вещество, вызывающее болезнь. Патогенами могут быть бактерии, вирусы, грибы, паразитические одноклеточные, черви, и даже инфекционные белки (прионы).
Первичное антитело: в иммунологическом тесте, антитело, связывающее антиген и дающее специфичность тесту.
Вторичное антитело: в иммунологическом тесте, антитело, связывающее первичное антитело. Часто вторичные антитела помечены определенным образом для того, чтобы можно было их обнаружить.
Пероксидаза хрена: фермент, часто использующийся для определения вторичных антител. Катализирует окисление разных субстратов перекисью водорода (H2O2). Если в результате реакции образуется окрашенный продукт, он может быть определен колориметрически.
Приобретенный иммунитет: специфический ответ на определенное чужеродное вещество, возникающий в результате нескольких контактов с ним.
Сероконверсия: появление детектируемого уровня антител против определенного агента в крови. Например, антитела к ВИЧ в крови можно обнаружить лишь через 6 недель после заражения.
Субстрат: молекула, на которую действует данный фермент
Сыворотка: прозрачная жидкость, получающаяся при удалении из крови крупных частиц, т.е. красных и белых кровяных клеток.
ТМБ: см. 3, 3’, 5, 5’-тетраметилбензидин
Фаговый дисплей: метод создания новых антител против определенных антигенов с помощью технологии рекомбинантной ДНК и бактериофагов.
Фермент: белок с каталитической активностью. Молекула, на которую действует фермент, называется субстратом. Ферменты классифицируют и называют по видам реакций, которые они катализируют.
Хромогенный: «дающий цвет». Хромогенными называют субстраты ферментативных реакций, которые в результате реакции дают окрашенные продукты. Например, 3, 3’, 5, 5’-тетраметилбензидин (ТМБ) при окислении пероксидазой хрена дает синий продукт.
Эпитоп: отдельный участок на поверхности антигена, с которым связывается антитело. Также называется «антигенной детерминантой».
Приложение В: Описания болезней
ВИЧ/СПИД
Подходящие протоколы: все
| Название патогена | Вирус иммунодефицита человека, ВИЧ |
| Тип организма | Ретровирус |
| Инфекционный агент | Вирус |
| Метод распространения | Половые контакты Использование общих игл при употреблении наркотиков Использование нестерильных медицинских инструментов От матери детям во время беременности При переливании крови или пересадке донорских органов Не распространяется при обычных контактах |
| Инкубационный период | От 2 месяцев до более 10 лет |
| Симптомы | В первые 1-2 месяца после заражения – симптомы гриппа Во время асимптоматического периода (от 2 месяцев до > 10 лет) иммунная система медленно разрушается, и симптомы могут включать в себя потерю веса, слабость, частые лихорадки, частые грибковые заболевания, сыпь на коже, ухудшение кратковременной памяти Во время развития СПИДа, из-за заражения оппортунистическими инфекциями может наблюдаться кашель, затруднение дыхания, судороги, потеря координации, нарушение сознания, частый понос, лихорадка, потеря зрения, тошнота, сильные головные боли, сильная слабость и кома. |
| Инфекционность | От времени заражения |
| Диагностика | В первые 4-8 недель после заражения вирус можно обнаружить с помощью ИФА к белку p24 или с помощью вестерн-блота После 4-8 недель с помощью ИФА можно обнаружить в крови антитела к ВИЧ |
| Лечение | Ингибиторы обратной транскриптазы, например АЗТ Ингибиторы протеазы Комплексное антиретровирусное лечение Лечение оппортунистических инфекций |
| Смертность | Широко варьирует в зависимости от географического положения больных |
| История | Первый известный случай в 1959 году. ВИЧ мог распространиться от животных к человеку. Болезнь была описана и названа синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД) в 1982 году, вирус иммунодефицита человека был выделен в 1983. |
Предполагаемые сценарии для класса:
Ролевая игра, в которой ученики выполняют роль ученых в клинической лаборатории местной больницы и делают тесты на ВИЧ. Существуют тесты ИФА на антиген к ВИЧ (капсидный белок p24) и на сывороточные антитела к ВИЧ.
Оспа
Подходящие протоколы: все
| Название патогена | Вирус оспы, Variola major |
| Тип организма | ДНК-вирус из рода Orthopoxvirus |
| Инфекционный агент | Вирус (для заражения достаточно нескольких вирусных частиц) |
| Метод распространения | От человека к человеку воздушно-капельным путем Через инфицированную одежду, постель или вещи Вирус может оставаться живым до 24 часов при оптимальных условиях |
| Инкубационный период | 12-14 дней |
| Симптомы | Высокая температура, недомогание, боли головы и тела, сыпь на коже, переходящая в гнойные пузырьки (оспины) |
| Инфекционность | Период максимальной инфекционности - начало появления сыпи, инфекционность сохраняется до полного исчезновения сыпи. |
| Диагностика | По симптомам. Идентификация вируса с помощью электронной микроскопии. Идентификация вирусной ДНК молекулярно-биологическими методами. Разработка ИФА к IgG, IgM и антителам - важная задача для многих компаний (оспа была уничтожена до того, как появились современные иммунологические методы диагностики) |
| Лечение | Вакцинация в течение 2-3 дней после заражения предотвращает развитие заболевания Вакцинация в течение 4-5 дней после заражения может предупредить смертельный исход болезни После 4-5 дней, только поддерживающее лечение. Экспериментальное антивирусное лечение |
| Смертность | До 30% |
| История | Использовался в качестве биологического оружия Великобританией в Северной Америке в 18 веке. Армия раздавала индейцам одеяла, снятые с оспенных больных. Смертность в некоторых племенах индейцев достигала 50%. В 1796 году Дженнер создал на основе коровьей оспы вакцину, защищающую людей от оспы. Усилия по всеобщей вакцинации позволили искоренить оспу в 1977 году, и вакцинации были прекращены. |
Предполагаемые сценарии для класса:
Протоколы I и II:
Ролевая игра: ваши ученики подверглись биологической атаке с использованием распыленного вируса оспы, возможно, кто-то заразился, в этом случае, ему необходима немедленная вакцинация. Вакцинировать всех подряд не очень хорошо, потому что вакцинация может иметь неприятные побочные эффекты Важно как можно быстрее узнать, кто заражен.
Протокол III:
Ролевая игра: ваши ученики исследуют, насколько долго сохраняются в крови антитела к оспе, полученные после вакцинации. Прививки были обязательны до 1978 года; надо определить, сохраняют ли современные 30-летние люди иммунитет к оспе.
|
|