Key words: genetic engineering, a recombinant DNA, vector, cloning, transgenic organisms

ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДОВ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ В БИОТЕХНОЛОГИИ

А. К. Гагиева, Пензенский государственный технологический университет

(г. Пенза, Россия)

RECOMBINANT DNA TECHNIQUES. USING OF GENETIC ENGINEERING METHODS IN BIOTECHNOLOGY

А. K. Gagieva, Penza State Technological University

(Penza, Russia)

В статье рассмотрены основные этапы создания рекомбинантных ДНК: получение генов или фрагментов ДНК для встраивания переноса, конструирование вектора для переноса генов или фрагментов ДНК, перенос полученной конструкции в клетку-реципиента, амплификация фрагментов ДНК в клетках-реципиента, расшифровка последовательности нуклеотидов (секвенирование) фрагментов ДНК и идентификация рекомбинантов. Изложены основные аспекты практического применения трансгенных микроорганизмов, животных и растений в биотехнологическом производстве и сельском хозяйстве.

Ключевые слова: генетическая инженерия, рекомбинантная ДНК, вектор, клонирование, трансгенные организмы

The article describes the main steps for creating recombinant DNA: preparation of genes or DNA fragments for embedding transfer construction of the vector to transfer the genes or DNA fragments, transfer of the resulting construct into a recipient cell, amplification of DNA fragments into cells of the recipient, nucleotide sequencing fragment DNA and identification of recombinants. The basic aspects of the practical application of transgenic microorganisms, plants and animals in biotechnological manufacturing and agriculture.

Key words: genetic engineering, a recombinant DNA, vector, cloning, transgenic organisms

С появлением технологии рекомбинантных ДНК в развитии биотехнологии начался новый этап. Появилась возможность оптимизировать этап биотрансформации более прямым путем: создавать, а не просто отбирать высокопроизводительные штаммы, использовать микроорганизмы и эукариотические клетки как «биологические фабрики» для производства инсулина, интерферона, гормона роста, вирусных антигенов и тому подобное.

Технология рекомбинантных ДНК позволяет получать в больших количествах ценные низкомолекулярные вещества и макромолекулы, что в естественных условиях синтезируются в минимальных концентрациях. Растения и животные стали «биореакторами», которые синтезируют новые или измененные генные продукты, которые никогда бы не могли быть созданы методами мутагенеза. В конце концов, эта новая технология способствует развитию принципиально новых методов диагностики и лечения различных заболеваний [2].

На стыке технологии рекомбинантных ДНК и биотехнологии возникла новая область исследования – генетическая инженерия. Ее стратегия и экспериментальная база испытывают быстрые изменения, разные подходы к решению той или другой проблемы быстро сменяют друг друга. Поэтому, можно сказать, что в ближайшем будущем, генетическая инженерия станет «рутинным методом» создания живых систем, которые имеют безграничные функции и возможности.

Исходя из актуальности темы целью работы стало детальное изучение основных этапов создания рекомбинантных ДНК и рассмотрение некоторых аспектов применения генетической инженерии в биотехнологии и сельском хозяйстве.

Под рекомбинантной понимают ДНК, образованную при воссоединении in vitro двух или больше фрагментов ДНК, выделенных из разных биологических источников. Ключевыми в этом определении являются слова " фрагмент ДНК" и " соединения in vitro", что указывает на суть генетической инженерии и ее отличие от всех других методов получения гибридных (химерных) организмов, таких как генетическая селекция, эмбриональная инженерия и др. [1].

Основными этапами создания рекомбинантных ДНК являются следующие:

1. Получение нужного гена, который будет переноситься. Ген может быть выделен из естественных источников (из соответствующего генома) или геномной библиотеки.

2. Создание специальных генетических конструкций – векторов (переносчиков), в составе которых гены будут перенесены в геном другого вида или клонированы в клетках про- или эукариот. Клонирование обеспечивает получение большого числа копий фрагментов ДНК, идентичных начальной.

3. Генетическая трансформация, то есть перенесение и включение генетических векторов (рекДНК) в клетки-мишени хозяина (реципиента).

4. Молекулярная селекция – отбор клонов с рекДНК с разными маркерными генами, которые находятся в векторной молекуле вместе с трансгеном [2].

Все манипуляции с генами in vitro осуществляются с участием различных ферментов. К основным ферментам, применяемым в генетической инженерии, относят специфические рестрикционные эндонуклеазы и ДНК-лигазы. Также используются различные ДНК-полимеразы и обратная транскриптаза [1].

На первом этапе для получения гена или фрагмента рекДНК используют один из двух подходов:

1. Химический синтез гена, который предусматривает знание последовательности нуклеотида в гене методами секвенирования. Таким образом был синтезирован ген аланиновой и тирозиновой тРНК Кораной [3].

2. Использование обратной транскриптазы ретровирусов.

Обратная транскриптаза имеет 3 ферментативных активности:

1) ДНК-полимеразную, используя как матрицу как РНК, так и ДНК;

2) активность РНКазы Н, которая гидролизует РНК в составе гибрида РНК-ДНК, но не одно- или двухцепочечную РНК;

3) ДНК-эндонуклеазную активность [2].

Первые две активности необходимы для синтеза вирусной ДНК, а эндонуклеаза является важной для интеграции вирусной ДНК в геном клетки-хозяина. Очищеная обратная транскриптаза синтезирует ДНК как на РНК-, так и на матрицах ДНК. Чтобы начать синтез, ревертазе нужен короткоцепочечный праймер.

Полученную двухцепочечную кДНК можно потом встраивать в клонирующие векторы, размножать в составе гибридных молекул ДНК и использовать для дальнейших исследований [5].

Обязательной генетической конструкцией, которая используется в генной инженерии, является вектор. Векторы – это молекулы ДНК, способные переносить включенные в них посторонние гены к клетке-реципиенту, где эти молекулы реплицируются автономно или после интеграции с геномом (хромосомой).

Вектор должен иметь следующие свойства:

1. Способность к автономной (то есть независимо от хромосомы реципиента) репликации в клетке реципиента.

2. Наличие сайта, в котором возможно встраивание желательного фрагмента ДНК. Для этого вектор должен содержать одну или два участка (сайты рестрикции), чувствительных к действию определенной рестриктазы, которая расщепляет вектор и позволяет встроить желаемый ген.

3. Наличие одного или нескольких маркерных генов, благодаря которым клетка-реципиент будет иметь новые признаки, которые позволяют отличить трансформируемые клетки. Такие гены кодируют ферменты, которые разрушают или модифицируют антибиотики, гербициды [2].

Как векторы широко используются плазмиды бактерий или дрожжей, ДНК бактериофагов или вирусов, искусственные хромосомы дрожжей (YAK) и бактерий (BAK). Созданы также гибридные (искусственные) векторы – космиды, сочетающие преимущества плазмид и фагов.

Плазмиды – внехромосомные генетические элементы про- и эукариот, которые автономно реплицирются в клетке. Естественные плазмиды часто содержат гены, которые отвечают за устойчивость бактерий к антибиотикам, контролируют способность расщеплять разные токсичные соединения (нафталин, камфору, толуол, ксилол, пестициды). Для генетической инженерии значительный интерес представляют многокопийные плазмиды, которые в клетке представлены большим числом копий (до 10-200 копий на клетку). Чаще всего векторы конструируют на основе естественных плазмид, удаляя целый ряд лишних генов.

Для растений используются векторы, сконструированные на основе Ti - и Ri- плазмид агробактерий. Эти бактерии поражают до 60 % двудольных растений и некоторые однодольные растения и вызывают формирование опухолей – корончатых галлов (Agrobacterium tumefaciens) или образование «косматых» корней (A. rhizogenes) [7].

Фаговые векторы чаще всего создают на основе умеренного бактериофага λ, который содержит двухцепочечную линейную молекулу ДНК. Левое и правое плечи фага имеют все гены, необходимые для литического цикла (репликации, размножения). Средняя же часть генома бактериофага λ (что содержит гены, контролирующие лизогению, то есть его интеграцию в ДНК бактерии-хозяина) не важна для его размножения и близко 50 % (≈ 25 тпн) может быть заменено на посторонний фрагмент ДНК. Такие модифицированные фаги проходят литический цикл. Векторы на основе бактериофага λ используют для клонирования фрагментов ДНК эукариот (то есть больших генов) размером до 23 тпн.

Космида – это векторная плазмида, предназначенная для клонирования больших фрагментов ДНК эукариот (до 45 тпн) в клетках E. coli. По сути, космида являтся плазмидой, внутри которой есть cos-сайт – участок фага, являющийся последовательностью нуклеотида, отвечающего за упаковку фаговой ДНК в ее капсид [6].

Часто полноразмерные гены и мультигенные комплексы (≥ 100 тпн) эукариот являются слишком большими для встраивания в обычные векторы. Для переноса больших трансгенов и их клонирования используют искусственные хромосомы дрожжей (YAK), содержащие фрагменты геномной ДНК длиной от 100 до 1 млн тпн.

Челночные векторы – это векторы (сконструированы на основе плазмидной ДНК), способные реплицироваться в клетках двух и больше организмов. Например, плазмида YEp24 способна размножаться в клетках дрожжей и E. coli. В этом случае векторы имеют специфические последовательности (специфические для дрожжей и E. coli) нуклеотидов, что позволяет им реплицироваться или в бактериальной, или в дрожжевой клетке [1].

Сшивания фрагментов ДНК осуществляют одним из трех основных методов, в зависимости от того, какие концы имеют фрагменты сшиваемой ДНК.

Сшивание по одноименным " липким" концам (рестриктазно-лигазный метод). Этот метод является самым распространенным и самым популярным. Некоторые рестриктазы на равных расстояниях от центра сайта узнавания образуют «ступеньку». Эти комплементарные друг другу участки имеют тенденцию к ассоциации за счет спаривания оснований, потому их называют липкими концами. Для сшивания, или лигирования нитей используют фермент ДНК-лигазу [3].

Сшивание по " тупым" концам (коннекторный метод). Тупые концы также могут быть соединены ДНК-лигазой, если и лигаза, и тупые концы присутствуют в реакционной смеси в высоких концентрациях. В этом случае реакция лигирования имеет свои особенности. Однако, ее эффективность несколько ниже, чем при сшивании по липким концам [4].

Сшивание фрагментов с разноименными липкими концами. Когда необходимо сшить фрагменты, образованные разными эндонуклеазами рестрикции с разными некомплементарными друг другу липкими концами, применяют так называемые линкеры (" переходники"). Линкеры – это химически синтезированный олигонуклеотид, который представляет собой сайты рестрикции или их комбинацию.

Часто в середину линкера встраивают какой-либо регуляторный генетический элемент, например, промотор или участок, связанный с рибосомой. В этом случае линкеры обеспечивают не только соединение генов, но и обусловливают их экспрессию [1]. Эти процедуры составляют основу для второго общего метода получения рекомбинантных молекул ДНК.

Известны многочисленные методы, с помощью которых можно встроить донорную ДНК в геном разных организмов. В качестве реципиентов, в геном которых будут встроенны гены, используют клеточные культуры, эмбрионные клетки млекопитающих, некоторых растений, дрозофиллы, пронуклеус млекопитающих, протопласты растений, незрелые зиготические зародыши, проростки. Трансформация экзогенной ДНК может осуществляться с использованием следующих методов:

1. Микроинъекция. С помощью тонких микроигл и микроманипулятора в клетку или прямо в ядро вводится векторная ДНК с включенным в нее трансгеном. С помощью микроинъекций осуществляется трансформация у дрозофилл, растений.

2. Электропорация. Растительные протопласты или животные клетки обрабатывают импульсами электрического поля высокого напряжения, которое обратно увеличивает проницательность биомембран. Через поры, которые образуются на короткое время, векторная ДНК проникает в клетку [5].

3. Перенесение ДНК в составе липосом. Липосомы – это искусственно созданные сферические образования, оболочка которых состоит из фосфолипидов. Липосомы, которые содержат внутри трансформирующую ДНК, способны непосредственно сливаться с мембраной клетки или поглощаться клетками в результате эндоцитоза. В клетке происходит разрушение оболочки липосом и освобождение рекДНК. Метод чаще всего используется для введения рекДНК в культуры животных клеток и растительные протопласты.

4. Бомбардировка микропулями (баллистическая трансформация). Это один из самых эффективных методов трансформации однодольных и хвойных растений (в которые не удается ввести донорную ДНК с помощью агробактериальных плазмид), а также трансформации животных клеток. Для «обстрела» тканей используют частицы из золота или вольфрама размером 0, 6-3 мкм, на которые наносится векторная ДНК. Этими частицами («микропулями») заряжают «генные» пушки. Микропули разгоняются в установке под действием электрического разряда или под давлением газа гелия. При достаточной скорости эти частицы могут непосредственно проникать в ядро, которое сильно повышает эффективность трансформации. Этим же методом можно трансформировать и другие ДНК-содержащие органеллы – хлоропласты и митохондрии [3].

5. Для многих двудольных растений эффективна векторная трансформация на основе агробактериальных Ti - и Ri- плазмид.

6. Эффективными переносчиками ДНК в реципиентные клетки животных являются «естественные шприцы» – вирусы (в бактериальную клетку – бактериофаги).

7. Одним из самых распространенных методов введения векторных ДНК в клетки реципиентов является метод трансформации. Для увеличения частоты трансформации получают протопласты клеток и трансформацию проводят в присутствии хлорида кальция. С помощью этого метода можно вводить двухцепочечные векторные ДНК (даже кольцевые), если их размер незначителен [1].

Для клонирования векторов в клетках реципиентов чаще всего используют методы конъюгации, трансдукции или метод обработки клеток хлорамфениколом, с последующим повышением температуры до 42-45⁰С. При этом блокируется репликация хромосомы, но происходит множественная репликация векторов, которая приводит к накоплению нескольких тысяч векторных молекул в клетках реципиента [2].

Одним из методов амплификации фрагментов ДНК в клетках реципиентов является полимеразная цепная реакция (ПЦР) [1].

Идентификацию рекомбинантов осуществляют:

1) по генетическим маркерам: чувствительности или устойчивости к антибиотикам, по проявлению прото- или ауксотрофности, по наличию или отсутствию метаболических признаков [5].

2) с помощью молекулярно-биологических методов с использованием ДНК-зондов – небольших по размеру молекул ДНК, радиоактивно меченых по Р и комплементарных последовательности генов, которые встраиваются. Они могут быть использованы при разгонке ДНК путем электрофореза [2].

Трансгенная технология представляет интерес не только для фундаментальной науки. Она открывает широкие перспективы для развития целого ряда прикладных областей, в частности биотехнологии и сельского хозяйства.

Одна из основных задач животноводства – повышение надоев, скорости роста и улучшение качества продукции [1].

Рост животных контролируется многими генами, зависит от условий питания и факторов окружающей среды и контроль над этими важными хозяйственными признаками является очень сложной задачей. Один из подходов в решении этой проблемы основан на использовании генов, кодирующих разнообразные факторы роста – гормон роста, инсулиноподобный фактор роста и др.

Первые трансгенные мыши с геномом гормона роста крысы (1982) имели увеличенную в два раза массу тела. У трансгенных свиней с геном рилизинг-фактора гормона роста конечная живая масса была на 15, 7 % выше обычных - контрольных животных. В то же время овцы с геном гормона роста, хотя и содержали повышенный уровень этого гормона в организме, не отличались от контрольных по скорости роста. Эти работы с одной стороны показывают перспективность использования трансгенных животных, а с другой – свидетельствуют о сложности и недостаточной изученности систем регуляции роста животных.

Трансгенные животные также находят применение в практике как продуценты биологически активных веществ. В медицинской практике широкое применение находят такие образующиеся в тканях человека белки как фактор свертываемости крови, гормон роста, инсулин, интерлейкин-2 и другие. Практическое получение этих белков может быть осуществлено путем создания рекомбинантных микроорганизмов, несущих ген соответствующих белков человека. Однако этот подход позволяет получить только некоторые белки, поскольку синтезирующиеся в клетках микроорганизмов белки не могут быть нормально гликозилированы или карбоксилированы, что приводит к потере их биологической активности. Эти белки могут быть синтезированы в культуре клеток, однако выход белка в этих системах низкий. Промышленные биореакторы для культивирования клеток животных достаточно дороги [1].

Перспективным подходом при получении белков могут быть трансгенные животные, несущие гены соотвествующих белков. Хотя получение трансгенных животных сложная задача, однако полученные животные могут продуцировать относительно большое количество белка с относительно низкой стоимостью. Перспективным является использование молочной железы крупного рогатого скота как места синтеза необходимых белков, т. е. использование ее в качестве биореакгора. Это связано с тем, что молочная железа обладает огромной синтетической белковой продуктивностью. Общая концентрация белков в молоке в зависимости от вида животного достигает 2 - 10 %.

Для коммерческого производства рентабельным является производство фармацевтически важных белков, если в1л содержится более грамма такого белка. Одним из этапов в получении трансгенных животных, продуцирующих гетерогенный белок с молоком, является использование промоторов, обеспечивающих экспрессию необходимых белков в молочной железе. В настоящее время выделены и используются такие промоторы генов, экспрессирующихся в молочной железе как β -казеин, aSl-казеин, α -лактоальбумин, β -лактоглобулин.

В настоящее время получены такие рекомбинантные белки, синтезирующиеся в молочной железе как: человеческий белок С, антигемофильный фактор IX, α -1-антитрипсин, лактоферрин, человеческий сывороточный альбумин, интерлейкин 7-2, урокиназа, тимозин. Однако большинство этих белков получено в эксперименте.

На промышленном уровне разработана (1992 г., Великобритания) технология получения человеческого альфа-1-антитрипсина в молочной железе трансгенных овец. Получена овца, в молоке которой содержится до 35 г/л этого белка (это около половины всех белков молока). Это позволяет получать 10 кг этого белка в год от одного животного, что достаточно для лечения 50 пациентов с эмфиземой легких [6].

Наиболее серьезные успехи в применении трансгенных животных, способных продуцировать белки для терапии, достигнуты в США, Шотландии и Нидерландах. В Нидерландах был получен трансгенный теленок, несущий ген человеческого лактоферрина, который транспортирует железо и обладает антибактериальными свойствами. В молоке трансгенных коз синтезировался активатор плазминогена, который используется для устранения тромбов.

Перенос генов – один из возможных способов лечения наследственных заболеваний у человека. При этом в качестве вектора могут быть использованы производные ретровирусов, у которых делетированы, необходимые для репликации гены gag, роl и env и встроены необходимые трансгены с их регуляторными последовательностями. В качестве клеток реципиентов можно использовать соматические клетки человека, наиболее удобны – стволовые клетки костного мозга. Эти клетки могут быть легко выделены, способны расти в культуре и после введения в них вектора их легко вновь ввести в тот же организм.

Первые эксперименты по генотерапии гемопоэтических стволовых клеток костного мозга с использованием ретровирусных векторов были проведены в начале 80-х годов на мышах с недостаточностью аденозиндеаминазы (АДА). Это было связано с тем, что недостаточность АДА является заболеванием клеток костного мозга и его можно лечить трансплантацией клеток костного мозга. Недостаточность АДА у человека ведет к тяжелому (летальному) комбинированному иммунодефициту.

Вторым важным направлением генотерапии является лечение онкозаболеваний у человека. Это осуществляется также трансформацией соматических клеток. Пациентам вводят собственные лимфоциты, в состав генома которых включен ген, синтезирующий фактор некроза опухоли (TNF). Трансформированные лимфоциты TNF были названы опухолеинфильтрующими лимфоцитами (TIL).

По мнению специалистов, лет через десять смогут лечить болезнь Альцгеймера, используя генетические модификации соматических клеток. Нет сомнений, что успехам в области генотерапии будут способствовать результаты, полученные при выполнении программы «Геном человека», направленной на полное определение нуклеотидных последовательностей всего генома человека [1].

Огромный прогресс в создании трансгенных растений позволяет все с большей определенностью конструировать растения с новыми свойствами, которые нельзя получить методами классической селекции. В растения можно вводить индивидуальные гены других неродственных растений, животных, бактерий, вирусов. Полученные трансгенные растения можно затем скрещивать между собой и получать варианты с двумя и более чужеродными генами. Это позволяет решать широкий круг проблем, обеспечивая большую экономическую выгоду.

Используя технологию рекомбинантных ДНК, получены растения, устойчивые к насекомым. Из генома бактерии Bacillus thuringiensis выделен ген отвечает за синтез токсина bt2. Этот токсин синтезируется в виде белка-протоксина и только в кишечнике насекомых он превращается в активный токсин под действием протеаз и приводит к гибели вредителей. Этот ген (bt2) был встроен в вектор под контролем промотора вируса мозаики цветной капусты и интегрирован в геном табака с помощью Ті-векторной системы. Полученные растения были устойчивы к насекомым. Ген эндотоксина был встроен и в геном томатов, которые приобрели устойчивость к насекомым [4].

Обнаружено, что при инфицировании растений вирусами, бактериями и грибами в клетках начинают синтезироваться белки - pathogen related proteins, среди которыххитиназа и β -1, 3-глюканаза. Эти ферменты ингибируют рост грибов и бактерий. Гены, обеспечивающие иммунную защиту растений, использованы для получения трансгенных растений, устойчивых к фитопатогенам.

Были получены трансгенные растения табака и турнепса, несущие гены хитиназы под промотором 35S-мозаики цветной капусты. Эти растения были устойчивы к фитопатогенам.

Важным направлением в биотехнологии растений является получение культурных растений, устойчивых к гербицидам (которые используются в борьбе с сорняками). Так, гербицид паракват проявляет свою активность, ингибируя фотосинтез. Это осуществляется за счет свободных радикалов кислорода. Как известно, супероксиддисмутаза переводит радикал в молекулярный кислород и перекись водорода. Был выделен ген SOD (супероксиддисмутазы) и включен в вектор под промотором 35S - вируса мозаики цветной капусты и перенесен в геном люцерны. У такой люцерны была повышена устойчивость к действию таких гербицидов как ацифлуорфен и паракват [1].

Растения, животные и микроорганизмы, модифицированные генно-инженерными методами, принято называть генетически измененными, а продукты их переработки для пищевых потребностей — трансгенными пищевыми продуктами илигенетически модифицированными источниками пищи (ГМИ).

Первый ГМИ – устойчивый при хранении томат сорта Flavr Savr («Calgene Inc.», США) – появился на продовольственном рынке США в 1994 г. В настоящее время спектр используемых ГМИ значительно расширился. Благодаря новым полезным свойствам трансгенные растения, как используемые в пищу, так и технические сельскохозяйственные культуры, становятся более технологичными и дешевыми и постепенно вытесняют сорта, полученные методами классической селекции. Площади возделывания трансгенных культур в мире растут с каждым годом. Однако во многих странах до сих пор идут жаркие споры о потенциальной опасности ГМИ. Несомненно, прежде чем попасть на прилавки магазинов, они должны проходить длительную процедуру всестороннего изучения возможных побочных эффектов на организм человека и животных. Должна исключаться возможность распространения трансгенов в окружающей среде. Однако в целом следует сказать, что опасения противников ГМИ не имеют каких-либо реальных подтверждений. У человечества нет альтернативы использованию новейших технологий получения ГМИ, так как классические подходы к созданию высокопродуктивных сортов себя во многом исчерпали, территории, пригодные для землепользования, практически освоены, а дефицит продуктов питания в целом на земном шаре будет с годами нарастать. И именно генетическая инженерия способна радикально решить встающие перед человечеством проблемы [7].

Подводя итог работы можно сделать следующее заключение. До эпохи рекомбинантных ДНК наиболее эффективным методом повышения производительности организмов был мутагенез с последующей селекцией оптимального штамма-продуцента. Это долгий, высоко затратный и небезошибочный процесс, позволяющий улучшить лишь некоторые свойства организмов. В то же время, технология рекомбинантных ДНК – это относительно быстрый, эффективный и прочный инструмент, обеспечивающий получение микроорганизмов с заданными генетическими характеристиками. Кроме того, этот инструмент может работать не только с микроорганизмами, но и с растениями и животными.

Два основных свойства отличают генетически модифицированные организмы от сортов и пород полученных путем селекции. Во-первых, генетическая модификация дает возможность переноса генетического материала между биологическими видами, что в естественных условиях невозможно. Во-вторых, переносится какой-то один или несколько генов, то есть меняется конкретный признак, тогда как в процессе естественного видообразования или при селекции происходят мутации с изменениями группы генов и, соответственно, появление нового вида, породы, сорта или многих новых признаков. Но наряду с массой положительных характеристик и свойств продукты генетической инженерии обязательно должны проходить санитарно-медицинскую и экологическую оценку на возможность негативных последствий для организмов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Божков А. И. Биотехнология. Фундаментальные и прикладные аспекты / А. И. Божков. – Х.: Федорко, 2008. – 363 с.

2. Глик Б. Молекулярная биотехнология: принципы и применение / Б. Глик, Дж. Пастернак. – М.: Мир, 2002. – 589 с.

3. Жимулев И.Ф. Общая и молекулярная генетика / И.Ф. Жимулев. – Новосибирск: Изд-во Новосиб. ун-та, 2002. – 458 с.

4. Попов В. Н. Принципы и основные методы генетической инженерии / В. Н. Попов, О. С. Машкина. – В.: ВГУ, 2009. – 39 с.

5. Рыбчин В.Н. Основы генетической инженерии / В.Н. Рыбчин. – СПб.: Изд-во СПбГТУ, 1999. – 521с.

6. Сельскохозяйственная биотехнология / В.С. Шевелуха [и др.]. – М.: Высш. шк., 2003. – 469 с.

7. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия / С.Н. Щелкунов. – Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2004. – 496 с.