Факторы, влияющие на гибель клеток и спор

Активность клеток, спор и вирусов в воздухе или жидких средах может снижаться в результате их разрушения (под воздействием тепла, радиации, химических агентов или меха­нических сил), при механическом отделении (фильтрованием или центрифугированием) или за счет ингибирования (при пе­реохлаждении, высушивании, воздействии химических реагентов). Жидкости стерилизуют в основном путем нагревания (в промышленности) или хлорирования (для бытовых нужд), а для стерилизации воздуха применяют главным образом фильтрование.

Рисунок 23 – Результаты экспериментального определения

скорости тепловой гибели клеток и спор: а – скорость гибели клеток E.coli в буферном растворе; б – скорость инактивации вегетативных спор Bacillus subtilis; в– скорость инактивации вегетативных спор Вacillus stearothermophilus.

На рисунке изображены результаты экспериментального изучения воздействия повышенной температуры на вегетатив­ные клетки и споры. В общем случае клетки погибают быстрее спор. Тепловая обработка приводит также к инактивации вирусов и бактериофагов, поэтому использующаяся в микробиологической промышленности тепловая стерилизация снижает как численность популяции жизнеспособных микроорганизмов, так и концентрацию (титр) вирусов в подаваемом в реактор потоке питательных веществ.

Гибель каждой конкретной клетки обусловливается термической денатурацией одного или нескольких жизненно важных для этой клетки белков, например ферментов. Кинетика превращений таких сложных молекул может изменяться во времени самым неожиданным образом. К тому же скорость молекулярных процессов, приводящих в конце концов к гибели клетки, зависит от состава среды, в том числе и от концентрации растворителя. Например, как показано в таблице 5, температура, при которой наступает коагуляция (денатурация с последующей интенсивной необратимой сшивкой молекул денатурированного белка) альбумина яичного белка, повышается с уменьшением содержания в системе воды.

Таблица 5 – Зависимость температуры коагуляции альбумина

от содержания воды

Эти и ряд других данных свидетельствуют о том, что в случае сравнительно обезвоженных организмов и структур (например, вирусов или спор) их инактивацию правильнее рассматривать как двухэтапный процесс, при котором сначала происходит гидратация, а затем, возможно и денатурация. Такому механизму отвечает зависимость скорости гибели от относительной влажности, обнаруженная в случае бактериофагов. Совместное влияние нескольких инактивирующих факторов не обязательно носит аддитивный характер; так, совместные обезвоживание и тепловая обработка могут быть менее эффективными, чем можно было бы предположить, судя по эффективности каждого из этих факторов в отдельности.

Как уже упоминалось, популяция состоит из множества клеток различного возраста. Природа клеточной стенки и путь метаболизма зависят от возраста данной клетки и культуры в целом. Следовательно, устойчивость клеток к тепловой или другой инактивации будет зависеть от их истории, т. е. от довольно неопределенного фактора, который далеко не всегда удается охарактеризовать количественно. В частности, клетки популяции, находящейся в фазе экспоненциального роста, имеют относительно проницаемые стенки, что способствует эффективному обмену растворенными веществами между внутриклеточным объемом и средой. Если эти растворенные вещества влияют на устойчивость белков, то можно ожидать, что их присутствие окажет влияние и на рост клеток в экспоненциальной фазе.

Линейная зависимость логарифма доли оставшихся в живых клеток от времени указывает на первый порядок процесса снижения численности популяции жизнеспособных клеток п:

(75)

Отсюда следует, что при постоянном k_d

(76)

Здесь n₀–концентрация спор или вегетативных клеток при t=0. Наклон прямой полулогарифмической зависимости равен – k_d; график зависимости ln k_d от обратной температуры также представляет собой прямую, поэтому зависимость k_d от температуры может быть выражена уравнением аррениусовского типа:

(77)

Для многих спор и вегетативных клеток величина параметра Ed лежит в диапазоне от 50 до 100 ккал/моль. Другой ранее применявшийся параметр D_r, равный 2, 303/k_d и называемый временем децимальной редукции (десятичным коэффициентом снижения численности популяции), представляет собой не что иное, как время, в течение которого численность популяции жизнеспособных клеток снижается в 10 раз.

Приведенные выше кинетические уравнения справедливы только при том условии, что количество спор или клеток в по­пуляции достаточно велико. По мере снижения числа клеток или спор (n) вероятность отклонений от величин, предсказываемых указанными уравнениями, возрастает, поскольку, например, при нормальном распределении стандартное отклонение возрастает пропорционально 1/n. Из предыдущего уравнения детермини­стической модели следует, что оставшаяся жизнеспособной доля популяции (если допустить, что в данных летальных условиях роста клеток не происходит) определяется уравнением

(78)

Если судьба каждого организма не зависит от других организмов, если организмы не самовоспроизводятся и если летальные условия одинаковы для каждого организма, то стохастический анализ процесса стерилизации показывает, что вероятность наличия в популяции N жизнеспособных организмов в любой момент времени t равна:

(79)

(! – факториал ())

Здесь Nо – численность жизнеспособных организмов в стерилизуемой жидкости непосредственно перед началом стерилизации.

В этом уравнении параметр k_d имеет тот же смысл, что и константа скорости в уравнении (75); в стохастической модели k_d можно интерпретировать как величину, обратную средней продолжительности жизни организма. По мере того как число организмов снижается до некоторой сравнительно малой величины, допущение о гомогенной популяции, достаточно полно описываемой одним параметром k_d, становится все менее и менее обоснованным. То есть, небольшая доля популяции отличается повышенной устойчивостью к тепловой обработке.

Иногда допускается, чтобы после стерилизации остается довольно значительное количество жизнеспособных организмов (так, в пастеризованном молоке высшего качества концентрация живых бактерий не должна превышать 30000 клеток в 1 мл). В других ситуациях, например при выращивании чистых культур, к стерилизации предъявляются значительно более жесткие требования. В таких случаях важно оценить вероятность гибели популяции, т. е. вероятность инактивации всех организмов. Подставляя в уравнение (80) N=0, получаем:

(80)

Отсюда следует, что вероятность выживания по меньшей мере одного организма составляет:

(81)

Обычно N₀> > 1, поэтому

(82)

где

(83)

Величину (1—Po) можно интерпретировать как долю стерилизаций, которые не должны приводить к полной гибели всех организмов.

В клетке имеется несколько альтернативных путей усвоения энергии и осуществления биосинтеза. Поэтому повышаются шансы организмов выжить в неблагоприятных условиях.

Самый простой подход к анализу популяции из т различных типов клеток (спор или вирусов) также сводится к допущению о независимости видов организмов; тогда суммарная популяция жизнеспособных организмов будет равна сумме ин­дивидуальных популяций, выражаемых уравнениями типа (76) с соответствующими индивидуальными коэффициентами k_di:

(84)

График этой зависимости в полулогарифмических ко­ординатах не должен представлять собой прямую. Значения индивидуальных параметров kdi не всегда известны; некоторые методы оценки верхнего и нижнего пределов значений n(t)/n₀ по начальным данным обсуждены Хатчинсоном и Лассом. Достоверность таких оценок зависит от точности исходных данных о гибели популяции и требует определения второй производной d²n/dt² при t=0.