Морфология бактерий. Тинкториальные свойства бактерий.

Морфология бактерий.

Прокариоты отличаются от эукариот по ряду основных признаков.

Отсутствие истинного дифференцированного ядра (ядерной мембраны).

Отсутствие развитой эндоплазматической сети, аппарата Гольджи.

Отсутствие митохондрий, хлоропластов, лизосом.

Неспособность к эндоцитозу (захвату частиц пищи).

Клеточное деление не связано с циклическими изменениями строения клетки.

Значительно меньшие размеры (как правило). Большая часть бактерий имеет размеры 0, 5- 0, 8 мкм * 2- 3 мкм.

По форме выделяют следующие основные группы микроорганизмов.

Шаровидные или кокки (с греч.- зерно).

Палочковидные.

Извитые.

Нитевидные.

Ø Кокковидные бактерии (кокки) по характеру взаиморасположения после деления подразделяются на ряд вариантов.

Микрококки. Клетки расположены в одиночку. Входят в состав нормальной микрофлоры, находятся во внешней среде. Заболеваний у людей не вызывают.

Диплококки. Деление этих микроорганизмов происходит в одной плоскости, образуются пары клеток. Среди диплококков много патогенных микроорганизмов- гонококк, менингококк, пневмококк.

Стрептококки. Деление осуществляется в одной плоскости, размножающиеся клетки сохраняют связь (не расходятся), образуя цепочки. Много патогенных микроорганизмов- возбудители ангин, скарлатины, гнойных воспалительных процессов.

Тетракокки. Деление в двух взаимоперпендикулярных плоскостях с образованием тетрад (т.е. по четыре клетки). Медицинского значения не имеют.

Сарцины. Деление в трех взаимоперпендикулярных плоскостях, образуя тюки (пакеты) из 8, 16 и большего количества клеток. Часто обнаруживают в воздухе.

Стафилококки (от лат.- гроздь винограда). Делятся беспорядочно в различных плоскостях, образуя скопления, напоминающие грозди винограда. Вызывают многочисленные болезни, прежде всего гнойно- воспалительные.

Ø Палочковидные формы микроорганизмов.

Бактерии- палочки, не образующие спор.

Бациллы- аэробные спорообразующие микробы. Диаметр споры обычно не превышает размера (“ширины”) клетки (эндоспоры).

Клостридии- анаэробные спорообразующие микробы. Диаметр споры больше поперечника (диаметра) вегетативной клетки, в связи с чем клетка напоминает веретено или теннисную ракетку.

Необходимо иметь в виду, что термин “бактерия” часто используют для обозначения всех микробов- прокариот. В более узком (морфологическом) значении бактерии- палочковидные формы прокариот, не имеющих спор.

Ø Извитые формы микроорганизмов.

Вибрионы и кампилобактерии- имеют один изгиб, могут быть в форме запятой, короткого завитка.

Спириллы- имеют 2- 3 завитка.

Спирохеты- имеют различное число завитков, аксостиль- совокупность фибрилл, специфический для различных представителей характер движения и особенности строения (особенно концевых участков). Из большого числа спирохет наибольшее медицинское значение имеют представители трех родов- Borrelia, Treponema, Leptospira.

Характеристика морфологии риккетсий, хламидий, микоплазм, более подробная характеристика вибрионов и спирохет будет дана в соответствующих разделах частной микробиологии.

Данный раздел завершаем краткой характеристикой (ключем) для характеристики основных родов микроорганизмов, имеющих медицинское значение, на основе критериев, применяемых в определителе бактерий по Берджи (Berge).

Тинкториальные свойства - зависящая от строения, способность воспринимать анилиновые красители.

Различают простые и сложные методы окраски. Простые за­ключаются в окраске препарата одним красителем; сложные методы (по Граму, Цилю — Нильсену и др.) включают последо­вательное использование нескольких красителей и имеют диффе­ренциально-диагностическое значение. Отношение микроорганиз­мов к красителям расценивают как тинкториальные свойства. Существуют специальные методы окраски, которые используют для выявления жгутиков, клеточной стенки, нуклеоида и разных цитоплазматических включений.

Простой метод. Фиксированный мазок окрасить каким-либо одним красителем, например фуксином водным (1—2 мин) или метиленовым синим (3—5 мин), промыть водой, высушить и микроскопировать.

Сложные (дифференциальные) методы окраски

окраска несколькими красителями. Используются для изучения тинкториальных свойств.

Сложные методы. Последовательно нанести на препа­рат определенные красители, различающиеся по химическому составу и цвету, протравы, спирты, кислоту и др. Это позволяет выявить определенные структуры клеток и дифференцировать одни виды микроорганизмов от других.

Существуютнесколько основных окрасок: по Грамму, по Цилю-Нельсону, по Ауески, Нейссера, Бури-Гинса.

8. - Простые и сложные методы окраски. Методы изучения подвижности бактерий

Различают простые и сложные методы окраски. Простые за­ключаются в окраске препарата одним красителем; сложные методы (по Граму, Цилю — Нильсену и др.) включают последо­вательное использование нескольких красителей и имеют диффе­ренциально-диагностическое значение. Отношение микроорганиз­мов к красителям расценивают как тинкториальные свойства. Существуют специальные методы окраски, которые используют для выявления жгутиков, клеточной стенки, нуклеоида и разных цитоплазматических включений.

Простой метод. Фиксированный мазок окрасить каким-либо одним красителем, например фуксином водным (1—2 мин) или метиленовым синим (3—5 мин), промыть водой, высушить и микроскопировать.

Сложные (дифференциальные) методы окраски

окраска несколькими красителями. Используются для изучения тинкториальных свойств.

Сложные методы. Последовательно нанести на препа­рат определенные красители, различающиеся по химическому составу и цвету, протравы, спирты, кислоту и др. Это позволяет выявить определенные структуры клеток и дифференцировать одни виды микроорганизмов от других.

Существуютнесколько основных окрасок: по Грамму, по Цилю-Нельсону, по Ауески, Нейссера, Бури-Гинса,

Окраска по Грамму. Генцианвиолет связывается с пептидогликаном клеточной стенки. Толстый слой пептидогликана грамположительных бактерий связывает много красителя, тонкий слой – грамотрицательных – мало. Раствор Люголя фиксирует краситель за счет образования комплекса – краситель-пептидогликан-йод. При обработке мазка спиртом грамотрицательные микроорганизмы быстро теряют краситель и обесцвечиваются, а грамположительные остаются окрашенными в синий цвет. Дополнительныйкраситель окрашивает грамотрицательные микроорганизмы в красный цвет.

КОН-тест. В каплю 3% КОН вносят полную петлю исследуемой культуры. Растирают культуру в течение 30 сек., периодически отрывая петлю от стекла. Щелочь разрушает клеточную стенку грамотрицательных бактерий и клеточное содержимое выходит наружу, вследствие чего вязкость капли резко возрастает. Содержимое капли тянется за петлей. Грамположительные бактерии не лизируются и вязкость капли не возрастает.

Окраска капсул по Бурри-Гинсу. Капсула не воспринимает красители, поэтому ее выявляют негативным контрастированием фона (черная тушь) по Бури. Дополнительная окраска тела микробной клетки позволяет визуализировать капсулу (метод Бурри-Гинса).

Окраска кислотоустойчивых бактерий по Цилю-Нильсену. Клеточная стенка кислотоустойчивых бактерий отличается высоким содержанием липидов. Они с трудом окрашиваются, но затем удерживают основной краситель при обесцвечивании кислотой. Некислотоустойчивые бактерии легко окрашиваются, а затем легко обесцвечиваются кислотой и окрашиваются дополнительным красителем.

Окраска спор по Ожешко. Метод Ожешко сходен с методом Циля-Нильсена, но отличается использованием раствора соляной кислоты в качестве протравы, разрыхляющей оболочку споры, которая плохо воспринимает красители.

Выявление волютина по Нейссеру. При окраске уксуснокислым метиленовым синим происходит химическое взаимодействие красителя и волютина. Зерна волютина окрашиваются в черный цвет. При промывке водой тело клетки обесцвечивается и затем докрашивается везувином в желто-коричневый цвет.

9- Механизмы и типы питания бактерий

Механизмы питания бактерий

Большинство бактерий живет в среде, мало подходящей для того, чтобы поддер­живать строгое соотношение воды, солей и органических веществ, без которого не­возможна жизнь. Это обусловливает необходимость постоянного и тщательного ре­гулирования обмена различными веществами, который происходит между клеткой и внешней средой и контролируется клеточной мембраной. Она проницаема для многих веществ, поток их идет в обоих направлениях (из клетки и в клетку), но структура мембраны такова, что она обладает избирательной и неравномерной про­ницаемостью, определяющей механизмы питания бактерий.

Питательные вещества из внешней среды поступают в бактериальную клетку с помощью трех основных механизмов: пассивной диффузии, облегченной диффу­зии и активного транспорта:

Пассивная диффузия осуществляется за счет различного содержания пита­тельных веществ в среде и в клетке и происходит в направлении от большей концен­трации к меньшей, т. е. по градиенту концентрации. Когда концентрация вещества по ту и другую сторону мембраны уравнивается, пассивная диффузия прекращается. Ее скорость зависит от величины градиента, но она имеет определенный предел. Та­ким путем в клетку проникает (и покидает ее) вода вместе с растворенными в ней различными мелкими молекулами, способными проходить через мелкие поры мем­браны. Для пассивной диффузии характерно отсутствие субстратной специфично­сти, и она не требует затраты энергии.

Облегченная диффузия характеризуется выраженной субстратной специфично­стью и протекает при обязательном участии специфических белков, локализованных в мембране; синтез некоторых из них индуцируется соответствующими субстратами. Эти белки, получившие название пермеаз (англ. permeate — проникать, проходить сквозь), обладают субстратной специфичностью. Они распознают и связывают молеку­лу субстрата на внешней стороне мембраны и обеспечивают каким-то образом ее пере­нос через мембрану. На внутренней поверхности мембраны комплекс пермеаза—суб­страт диссоциирует, освободившаяся молекула субстрата включается в общий метаболизм клетки, а пермеаза повторяет очередной цикл переноса своего субстрата, который не способен проникать через мембрану путем простой диффузии. Главное свойство пер-меаз - способность проходить через мембрану как с присоединенной молекулой суб­страта, так и без нее. Однако облегченная диффузия происходит только по градиенту концентрации, но не против него, поэтому она не требует затраты энергии. Пермеазы, присоединившись к субстрату, повышают его способность проникать через мембрану. Облегченная диффузия протекает со значительно более высокой скоростью, чем пас­сивная. Ее скорость подчиняется закону Михаэлиса-Ментен, и при достижении равно­весия концентрация субстрата, доставляемого посредством облегченной диффузии, на внутренней и внешней поверхностях мембраны становится одинаковой.

Активный транспорт. С помощью механизмов активного транспорта растворен­ные вещества могут поступать в клетку против градиента концентрации, поэтому ак­тивный транспорт требует от клетки затраты энергии. У бактерий этот механизм пи­тания является преобладающим. С его помощью они обеспечивают такие концентрации растворенных питательных веществ внутри клетки, которые могут во много раз превышать их концентрации во внешней среде и обеспечивают им высокие скорости метаболизма даже при низкой концентрации химических веществ в окружающей сре­де. У многих бактерий, в особенности грамотрицательных, в активном транспорте принимают участие особые связывающие белки, не идентичные пермеазам и не вхо­дящие в структуру мембраны, а локализованные в периплазматическом пространстве. У связывающих белков отсутствует каталитическая активность, но они обладают очень высоким сродством к определенным питательным веществам — к различным аминокислотам, сахарам, неорганическим ионам. Выделено и изучено более 100 раз­личных связывающих белков, которые образуют прочные комплексы со своими суб­стратами и необходимы для их активного переноса через мембрану. Связывающие белки функционируют только в комплексе со специфическими пермеазами, осуществ­ляющими активный перенос субстрата через мембрану. Метаболическая энергия, необходимая для этого, используется для снижения сродства пермеазы к своему суб­страту на внутренней поверхности мембраны по сравнению с ее сродством к нему на внешней стороне мембраны. В результате этих превращений происходит изменение скорости выхода субстрата наружу, она становится во много раз меньше скорости его поступления в клетку. При этом механизме активного транспорта через мембрану в клетку поступают против градиента концентрации химически не измененные пита­тельные вещества. У бактерий, вместе с тем, существуют и такие транспортные систе­мы, которые переводят питательные вещества в химически измененную форму, не способную проникать через мембрану. К их числу относится фосфотрансферазная си­стема, широко распространенная среди бактерий. С помощью этой системы транспор­тируются многие сахара и их производные, в процессе переноса они фосфорилируют-ся и поступают в клетку в виде сахарофосфатов. Поскольку мембрана для последних непроницаема, сахарофосфаты остаются внутри клетки.

Фосфотрансферазная система состоит из двух неспецифических компонентов: ферментов I и НРг и набора субстрат-специфических белков, связанных с мембра­ной и обозначенных как ферменты II. Фермент I обеспечивает перенос богатой энер­гией фосфатной группы от фосфоенолпирувата на гистидиновый остаток фермента НРг, который превращается в фосфо-HPr. Последний является общим донором фо-сфорильной группы для всех субстратов, переносимых фосфотрансферазной систе­мой. Фосфорилирование же их осуществляется субстрат-специфическими белками из группы ферментов II, которые выполняют также и функции пермеаз. У мутант-ных бактерий, лишенных фермента I или белка НРг, ферменты И осуществляют об­легченную диффузию своих субстратов.

Транспортные системы в жизни клетки выполняют две основные функции:

поддерживают на высоком уровне внутриклеточные концентрации всех суб­стратов, необходимых для осуществления важнейших биохимических реакций с максимальными скоростями даже при низких концентрациях этих химических веществ во внешней среде;

регулируют внутриклеточное осмотическое давление, поддерживают опти­мальную для метаболической активности концентрацию растворенных веществ (небольших молекул и ионов).

Способы питания

Ø Углеродное питание

К числу важнейших химических элементов-органогенов, необходимых для син­теза органических соединений, относят: углерод, азот, водород и кислород. Свою по­требность в водороде и кислороде бактерии удовлетворяют за счет воды. Сложнее обстоит дело с углеродным и азотным питанием. По способу углеродного питания бактерии делят на аутотрофы и гетеротрофы.

Аутотрофы (греч. autos — сам, trophe — питание) — организмы, которые полно­стью удовлетворяют свои потребности в углероде за счет С0₂.

Гетеротрофы (греч. heteros — другой, trophe — питание, т. е. «питаемые други­ми») — организмы, которые не могут удовлетворить свои потребности в углероде только за счет С0₂, а требуют для питания готовых органических соединений. В свою очередь, гетеротрофов подразделяют на сапрофитов (греч. sapros — гнилой, phyton — растение), т. е. гетеротрофов, источником питания которых служат мерт­вые органические субстраты; и паразитов (греч. para — при, sitos — пища), т. е. гете­ротрофов, живущих за счет живых тканей животных и растений. Для превращения С0₂ в органические соединения требуется энергия: чтобы восстановить С0₂ в один моль гексозы требуется около 112 ккал. Существует два источника этой энергии -фотосинтез и хемосинтез.

Фотосинтез.

Это синтез за счет энергии солнечного света: свободная энергия фотона красного света (680 нм) AG = 41 ккал/моль, голубого (400 нм) — AG = = 65 ккал/моль. В результате фотосинтеза растительность земного шара ежегодно синтезирует более 100 млрд тонн органических веществ. На это используется около 200 млрд тонн С0₂, и в атмосферу выделяется около 145 млрд тонн свободного 0₂. Общее количество солнечной энергии, используемой ежегодно для фотосинтеза, со­ставляет не менее 3 ■ 10²¹ Дж.

Реакция фотосинтеза осуществляется в две фазы. В первой (световые реакции) — под действием фотонов электрон хлорофилла переходит в возбужденное состояние; затем, возвращаясь в свое обычное энергетическое состояние, он освобождает энер­гию, которая используется для синтеза таких молекул, как АТФ и НАДФН₂. Во вто­рой фазе (темновые реакции) АТФ и НАДФН₂ используются для восстановления С0₂ в глюкозу.

Суммарная реакция фотосинтеза такова:

6С0₂ + 6Н₂0 ------- энергия света----- ^ С₆Н₁₂0₆ + 60₂ + 112 ККал/мОЛЬ.

Таким образом, молекула глюкозы, которая представляет собой конечный про­дукт фотосинтеза (наряду с кислородом), содержит большое количество солнечной энергии (около 690 ккал на 1 моль), заключенной в ее молекулярной структуре. Гете­ротрофные организмы извлекают эту энергию путем последовательного расщепления молекулы глюкозы для того, чтобы «законсервировать» содержащуюся энергию ^в форме вновь образующихся молекул АТФ — универсальных хранителей и носите­лей энергии, необходимой для жизни всех клеток.

К фотосинтезирующим бактериям — фототрофам — относятся цианобактерии (сине-зеленые водоросли), пурпурные и зеленые бактерии, а также некоторые архе-оактерии.

Цианобактерии — различные многоклеточные нитчатые и одноклеточные ор­ганизмы, среди них есть подвижные формы, которые передвигаются с помощью скольжения. У цианобактерий, как и у растений, фотосинтез осуществляется с помо­щью хлорофилла и сопровождается выделением свободного кислорода.

Архебактерии (экстремальные галофилы) осуществляют особую форму фото­синтеза. У них вместо хлорофилла в фотосинтезе участвует особый пигмент — бак-териородопсин (комплекс каротиноида ретиналя с белком), который под влиянием света претерпевает фотохимические превращения, непосредственно сопряженные с синтезом АТФ.

Пурпурные и зеленые бактерии содержат различные по составу хлорофиллы (бактериохлорофиллы а, Ь, с, d и е) и каротиноиды. Большинство зеленых бакте­рий — мелкие, неподвижные грамотрицательные палочки. Пурпурные бактерии представлены грамотрицательными палочками, кокками или спириллами и часто имеют жгутики. У пурпурных бактерий хлорофилл замаскирован пурпурно-крас­ным или коричневым пигментом, а фотосинтезирующий аппарат заключен в кле­точную мембрану, у зеленых — в клеточную мембрану или в специальные органел-лы — хлоробиум-везикулы, локализованные в цитоплазме или мембране. В отличие от растений, водорослей и цианобактерий при фотосинтезе пурпурные и зеленые бактерии не выделяют 0₂, так как для восстановления С0₂ они используют в ка­честве доноров электронов не водород Н₂0, а водород H₂S. При этом пурпурные бак­терии окисляют H₂S до H₂S0₄.

Хемосинтез.

Русским ученым С. Н. Виноградским в 1880-1890 гг. было обнаружено, что не­которые грамотрицательные бактерии используют для своего роста энергию хемо­синтеза, т. е. энергию, получаемую за счет окисления неорганических соединений. Такие организмы получили название хемоавтотрофов. Им было установлено, что хемоавтотрофы характеризуются двумя важнейшими особенностями:

Обладают высокой специфичностью в отношении неорганического источника энергии.

Очень часто они не только не способны использовать в качестве источников углерода и энергии органические вещества, но последние даже могут угнетать их рост.

К хемоавтотрофам относятся открытые С. Н. Виноградским нитрифицирующие бактерии, представленные двумя группами. Представители одной из них (роды Nitrosomonas, Nitrosospira, Nitrosococcus, Nitrosoglobus) окисляют NH, до азотистой кислоты.

Таким образом, по способу углеродного питания все организмы можно подразде­лить на три основные группы.

Фотолитотрофы (источник энергии — солнечный свет, доноры электронов — неорганические соединения).

Хемолитотрофы (источник энергии — окислительно-восстановительные реакции, доноры электронов — неорганические соединения).

Хемоорганотрофы (источник энергии — окислительно-восстановительные реакции, доноры электронов — органические соединения). Большинство патоген­ных бактерий относится к хемоорганотрофам.

Ø Азотное питание

По способу азотного питания бактерии подразделяют на аминоавтотрофов и аминогетеротрофов. Аминоавтотрофы способны полностью удовлетворять свои потребности в азоте, необходимом для синтеза главным образом белков и нуклеи­новых кислот, с помощью атмосферного или минерального азота. Аминогетеротрофы нуж­даются для своего питания в готовых органиче­ских азотистых соединениях: некоторых амино­кислотах, основаниях, витаминах и др.

10 - Ферменты бактерий. Использование ферментативной активности бактерий при их идентификации

Ферменты (греч. fermentum — закваска), или энзимы, — специфические белковые катализаторы, присутствующие во всех живых клетках. Их нет у плазмид, у некоторых вирусов. Ферменты снижают энергию активации, которая необходима для осуществ­ления той или иной химической реакции. Они направляют ее обходным путем через промежуточные реакции, требующие значительно меньшей энергии активации. Под влиянием ферментов происходит перераспределение электронных плотностей и неко­торая деформация молекул субстрата, наступающая при образовании промежуточно­го фермент-субстратного комплекса. Эта деформация приводит к ослаблению внутри­молекулярных связей и, следовательно, к понижению необходимой энергии актива­ции, в результате чего скорость реакции возрастает. Открытию различных ферментов и изучению путей биохимических реакций, катализируемых ими, во многом способ­ствовали работы с использованием в качестве объектов исследования бактерий, осо­бенно ауксотрофов.

У бактерий обнаружены все шесть классов ферментов:

оксидоредуктазы (катализируют окислительно-восстановительные реакции);

трансферазы (катализируют реакции переноса групп атомов);

гидролазы (катализируют гидролитическое расщепление различных соединений);

лиазы (катализируют реакции отщепления от субстрата той или иной химической группы негидролитическими путями с образованием двойной связи или, наоборот, присоединение химической группы к двойным связям);

изомеразы (катализируют внутримолекулярные превращения);

лигазы, или синтетазы (катализируют соединение двух молекул, сопряженное с расщеплением пирофосфатной связи в молекуле АТФ или аналогичного трифосфата).

Изучение ферментов, обнаруживаемых у бактерий, представляет большой инте­рес для микробиологической промышленности. Изучение особенностей обмена ве­ществ патогенных бактерий необходимо прежде всего для понимания механизмов, с помощью которых они реализуют свою патогенность, т. е. для выяснения сущности патогенеза инфекционных заболеваний. Изучение биохимических свойств бактерий широко используется как для их систематики и классификации, так и для идентифи­кации, т. е. для диагностики.

У бактерий обнаружены уникальные генетические механизмы контроля биосин­теза ферментов, они проявляются в виде феноменов индукции и репрессии. Индук­ция заключается в том, что синтез ферментов наступает только в присутствии специ­фических химических веществ, которые являются субстратом для данного фермента или аналогом этого субстрата. Например, синтез ферментов, участвующих в потреб­лении лактозы у Е. coli, начинается (индуцируется) и происходит только при наличии в среде лактозы. Как только она исчезает, синтез этих ферментов прекращается.

Под эффектом репрессии понимают явление, при котором синтез фермента по­давляется (репрессируется) под влиянием специфических химических соединений, почти всегда являющихся непосредственными продуктами (или аналогами продук­тов) реакции, катализируемой этим ферментом. Например, синтез ферментов, уча­ствующих в образовании метионина у Е. coli, прекращается, как только в среде на­капливается избыток этой аминокислоты. Нетрудно видеть, насколько совершенен такой механизм саморегуляции биохимических процессов.

В соответствии с этими особенностями генетического контроля, у бактерий раз­личают три основные группы ферментов: конститутивные, синтез которых про­исходит в течение всего клеточного цикла; индуцибелъные, синтез которых инду­цируется соответствующим субстратом; и репрессибелъные, синтез которых подав­ляется в результате избыточного накопления продукта реакции, катализируемой данным ферментом (ферментами).

11 - Типы дыхания бактерий

Дыхание (или биологическое окисление) микроорганизмов представляет собой совокупность биохимических процессов, в результате которых освобождается энергия, необходимая для жизнедеятельности микробных клеток.

Все физиологические процессы, такие как движение, рост и размножение, образование спор и капсул, выработка токсинов, могут осуществляться при постоянном притоке энергии. Микроорганизмы добывают энергию за счет окисления различных химических соединений: углеводов (чаще глюкозы), спиртов, органических кислот, жиров и т. д. Сущность окисления состоит в том, что окисляемое вещество отдает электроны, а восстанавливаемое получает их.

По типу дыхания все микроорганизмы разделяются на облигатные (строгие) аэробы, облигатные анаэробы и факультативные (необязательные) анаэробы.

Облигатные аэробы (микобактерии туберкулеза и др.) живут и развиваются при свободном доступе кислорода, т. е. реакции окисления осуществляются у них при участии молекулярного кислорода с высвобождением большого количества энергии. Примером может служить окисление глюкозы в аэробных условиях: 82, 6 кД (688, 5 ккал)

Существуют и микроаэрофилы, которые нуждаются в малых количествах кислорода (некоторые лептоспиры, бруцеллы).

Облигатные анаэробы (клостридии столбняка, ботулизма и др.) способны жить и размножаться только в отсутствие свободного кислорода воздуха. Дыхание у анаэробов происходит путем ферментации субстрата с Образованием небольшого количества энергии. Так, при анаэробном разложении 1 моль глюкозы энергии выделяется значительно меньше, чем при аэробном дыхании: С6Н12О6~2С2Н5ОН + 2СО2+130, 6 кД (31, 2 ккал)

Наличие свободного кислорода для облигатных анаэробов является губительным. Это связано с тем, что в присутствии кислорода конечным продуктом окисления органических соединений оказывается перекись водорода. А поскольку анаэробы не обладают способностью продуцировать фермент каталазу, расщепляющую перекись водорода, то она накапливается и оказывает токсическое действие на бактерии.

Факультативные анаэробы могут размножаться как при наличии молекулярного кислорода, так и при отсутствии его. К ним относят большинство патогенных и сапрофитных бактерий.

Процессы разложения органических веществ в бескислородных условиях, сопровождающиеся выделением энергии, называют также брожением. В зависимости от участия определенных микроорганизмов и конечных продуктов расщепления углеводов различают несколько типов брожения: спиртовое, осуществляемое дрожжами; молочнокислое, вызываемое молочнокислыми бактериями; масляно-кислое, обусловленное масляно-кислыми бактериями и др.

Выделение тепла при дыхании микроорганизмов можно наблюдать при выращивании культур в сосудах, защищенных от потери тепла, - температура питательной среды будет постепенно повышаться. С выделением избыточного тепла при дыхании некоторых микроорганизмов связаны процессы самовозгорания торфа, навоза, влажного сена и хлопка.

12. Рост и размножение бактерий. Фазы размножения

Для микробиологической диагностики, изучения микроорганизмов и в биотехнологических целях микроорганизмы культивируют на искусственных питательных средах.

Под ростом бактерий понимают увеличение массы клеток без изменения их числа в популяции как результат скоординированного воспроизведения всех клеточных компонентов и структур. Увеличение числа клеток в популяции микроорганизмов обозначают термином " размножение". Оно характеризуется временем генерации (интервал времени, за который число клеток удваивается) и таким понятием, как концентрация бактерий (число клеток в 1 мл).

В отличие от митотического цикла деления у эукариотов размножение большинства прокариотов (бактерий) идет путем бинарного деления, а актиномицетов — почкованием. При этом все прокариоты существуют в гаплоидном состоянии, поскольку молекула ДНК представлена в клетке в единственном числе.

При изучении процесса размножения бактерий необходимо учитывать, что бактерии всегда существуют в виде более или менее многочисленных популяций, и развитие бактериальной популяции в жидкой питательной среде в периодической культуре можно рассматривать как замкнутую систему. В этом процессе выделяют 4 фазы:

• 1-я — начальная, или лаг-фаза, или фаза задержки размножения, — характеризуется началом интенсивного роста клеток, но скорость их деления остается невысокой;

• 2-я — логарифмическая, или лог-фаза, или экспоненциальная фаза, — характеризуется постоянной максимальной скоростью деления клеток и значительным увеличением числа клеток в популяции;

• 3-я — стационарная фаза — наступает тогда, когда число клеток в популяции перестает увеличиваться. Это связано с тем, что наступает равновесие между числом вновь образующихся и гибнущих клеток. Число живых бактериальных клеток в популяции на единицу объема питательной среды в стационарной фазе обозначается как М-концентрация. Этот показатель является характерным признаком для каждого вида бактерий;

• 4-я — фаза отмирания (логарифмической гибели) — характеризуется преобладанием в популяции числа погибших клеток и прогрессивным снижением числа жизнеспособных клеток популяции. Прекращение роста численности (размножения) популяции микроорганизмов наступает в связи с истощением питательной среды и/или накоплением в ней продуктов метаболизма микробных клеток. Поэтому, удаляя продукты метаболизма и/или заменяя питательную среду, регулируя переход микробной популяции из стационарной фазы в фазу отмирания, можно создать открытую биологическую систему, стремящуюся к устранению динамического равновесия на определенном уровне развития популяции.

Такой процесс выращивания микроорганизмов называется проточным культивированием (непрерывная культура). Рост в непрерывной культуре позволяет получать большие массы бактерий при проточном культивировании в специальных устройствах (хемостатах и турбидистатах) и используется при производстве вакцин, а также в биотехнологии для получения различных биологически активных веществ, продуцируемых микроорганизмами.

Для изучения метаболических процессов на протяжении цикла клеточного деления возможно также использование синхронных культур — таких культур бактерий, все члены популяции которых находятся в одной фазе цикла. Это достигается с помощью специальных методов культивирования.

Однако через несколько одновременных делений синхронизированная клеточная суспензия постепенно снова переходит к асинхронному делению, так что число клеток увеличивается в дальнейшем уже не ступенчато, а непрерывно.

При культивировании на плотных питательных средах бактерии образуют колонии — видимое невооруженным глазом скопление бактерий одного вида, являющееся чаще всего потомством одной клетки.

Колонии бактерий разных видов отличаются:

• формой;

• величиной;

• прозрачностью;

• цветом;

• высотой;

• характером поверхности и краев;

• консистенцией.

Характер колоний — один из таксономических признаков бактерий

13. Основные принципы культивирования бактерий. Методы культивирования анаэробов

Для выращивания бактерий используют следующие способы их культивирования: стационарный, глубинный с аэрацией и с использованием проточных питательных сред.

Стационарный способ: питательные среды сохраняются постоянными, с ними никаких дополнительных манипуляций не производят. Однако при таком способе культивирования в жидких питательных средах, где преобладают анаэробные энер­гетические процессы, выход биомассы незначителен. Поэтому в связи с развитием микробиологической промышленности были разработаны принципиально новые способы культивирования, позволяющие получать гораздо больший выход биомас­сы или биологически активных соединений. К их числу относятся метод глубинно­го культивирования с аэрацией и метод использования проточных сред.

Метод глубинного культивирования с аэрацией. Для выращивания с помо­щью этого способа применяют специальные устройства — реакторы. Они представ­ляют собой герметические котлы (приспособленные автоклавы), в которые залива­ется жидкая питательная среда. Реакторы снабжены автоматическими приспособле­ниями, позволяющими поддерживать постоянную температуру, оптимальные рН и гН₂, дозированное поступление необходимых дополнительных питательных ве­ществ. Однако главная особенность таких реакторов в том, что они постоянно про­дуваются стерильным воздухом и в них установлены мешалки, с помощью которых среда постоянно перемешивается. Поэтому во всей питательной среде создается та­кая концентрация свободного кислорода, при которой энергетические процессы происходят в аэробных условиях, т. е. достигается максимальное использование энергии, заключенной в глюкозе, а следовательно, и максимальный выход биомас­сы. Для примера: выход биомассы при стационарном методе культивирования Е. colt в МПБ через 18—20 ч составляет 1—2 млрд клеток на 1 мл среды, а при глубинном методе через 12-14 ч - 50-60 млрд клеток/мл среды.

Использование проточных питательных сред позволяет создать условия, при которых клетки имеют возможность длительное время находиться в определенной фазе роста (экспоненциальной) при постоянной концентрации питательных ве­ществ и в одних и тех же условиях, обеспечивающих непрерывный рост культуры. Методы получения непрерывных культур основаны на том, что в аппарат, где растут клетки, непрерывно добавляют свежую питательную среду и одновременно из него удаляют соответствующее количество бактерий.

Различают два типа таких аппаратов: хемостаты и турбидостаты.

Хемостат — ап­парат, в который постоянно из особого резервуара добавляется свежая питательная среда. Благодаря механическому перемешиванию и аэрации среды в ней создаются оптимальные условия для снабжения бактерий кислородом и вновь добавляемыми питательными веществами, по мере поступления которых часть популяции бакте­рий из аппарата удаляется.

Принцип работы турбидостата основан на поддержании постоянной плотности (мутности) бактериальной популяции в аппарате. Степень мутности контролируется с помощью фотоэлементов, которые через систему реле регулируют поступление пи­тательных веществ в аппарат. Все питательные вещества в ней содержатся в избытке, и скорость роста приближается к максимальной. В таких аппаратах непрерывного культивирования микроорганизмов (АНКМ) все необходимые параметры для роста соответствующего вида микроорганизма задаются и поддерживаются с помощью спе­циальных автоматических приборов. Благодаря сохранению неизменных условий среды непрерывная культура постоянно находится в наиболее желательной фазе ро­ста, при которой обеспечивается максимальный выход биологически важных соедине­ний (антибиотики, витамины, аминокислоты и т. п.) либо биомассы. Таким образом, в соответствии со способами культивирования различают периодические (при ста­ционарном и глубинном методах культивирования) и непрерывные (при проточном способе) культуры микроорганизмов. Кроме того, при определенных условиях полу­чают синхронные культуры, т. е. культуры, в которых все клетки одновременно (синхронно) делятся. Однако такая синхронность сохраняется, как правило, в течение 2—3 циклов деления, а затем она нарушается. Синхронные культуры используют в ос­новном для изучения тех или иных стадий клеточного цикла бактерий и роли отдель­ных генов (и их продуктов) в их осуществлении.

Методы культивирования анаэробов.

Для культивирования анаэробов необходимо понизить окислительно-восстановительный потенциал среды, соз­дать условия анаэробиоза, т. е. пониженного содержания кислорода в среде и окружающем ее пространстве. Это достигается применением физических, химических и био­логических методов.

Физические методы. Основаны на выращивании мик­роорганизмов в безвоздушной среде, что достигается:

посевом в среды, содержащие редуцирующие и легко окисляемые вещества;

посевом микроорганизмов в глубину плотных пи­тательных сред;

механическим удалением воздуха из сосудов, в ко­торых выращиваются анаэробные микроорганизмы;

заменой воздуха в сосудах каким-либо индиффе­рентным газом.

В качестве редуцирующих веществ обычно использу­ют кусочки (около 0, 5 г) животных или растительных тканей (печень, мозг, почки, селезенка, кровь, картофель, вата). Эти ткани связывают растворенный в среде кис­лород и адсорбируют бактерии. Чтобы уменьшить содер­жание кислорода в питательной среде, ее перед посевом кипятят 10—15 мин, а затем быстро охлаждают и зали­вают сверху небольшим количеством стерильного вазе­линового масла. Высота слоя масла в пробирке около 1 см.

В качестве легко окисляемых веществ используют глю­козу, лактозу и муравьинокислый натрий.

Лучшей жидкой питательной средой с редуцирующи­ми веществами является среда Китта — Тароцци, кото­рая используется с успехом для накопления анаэробов при первичном посеве из исследуемого материала и для поддержания роста выделенной чистой культуры анаэ­робов.

Посев микроорганизмов в глубину плотных сред про­изводят по способу Виньяль — Вейона, который состоит в механической защите посевов анаэробов от кислорода воздуха. Берут стеклянную трубку длиной 30 см и диа­метром 3—6 мм. Один конец трубки вытягивают в ка­пилляр в виде пастеровской пипетки, а у другого конца делают перетяжку. В оставшийся широкий конец трубки вставляют ватную пробку. В пробирки с расплавленным и охлажденным до 50°С питательным агаром засевают исследуемый материал. Затем насасывают засеянный агар в стерильные трубки Виньяль — Вейона. Капилляр­ный конец трубки запаивают в пламени горелки и трубки помещают в термостат. Так создаются благоприятные условия для роста самых строгих анаэробов. Для выде­ления отдельной колонии трубку надрезают напильни­ком, соблюдая правила асептики, на уровне колонии, ло­мают, а колонию захватывают стерильной петлей и переносят в пробирку с питательной средой для дальней­шего выращивания и изучения в чистом виде.

Удаление воздуха производят путем его механическо­го откачивания из специальных приборов — анаэроста-тов, в которые помещают чашки с посевом анаэробов. Переносный анаэростат представляет собой толстостен­ный металлический цилиндр с хорошо притертой крыш­кой (с резиновой прокладкой), снабженный отводящим краном и вакуумметром. После размещения засеянных чашек или пробирок воздух из анаэростата удаляют с помощью вакуумного насоса.

Замену воздуха индифферентным газом (азотом, во­дородом, аргоном, углекислым газом) можно производить в тех же анаэростатах путем вытеснения его газом из баллона.

Химические методы. Основаны на поглощении кисло­рода воздуха в герметически закрытом сосуде (анаэро-стате, эксикаторе) такими веществами, как пирогаллол или гидросульфит натрия Na₂S20₄.

Биологические методы. Основаны на совместном вы­ращивании анаэробов со строгими аэробами. Для этого из застывшей агаровой пластинки по диаметру чашки вырезают стерильным скальпелем полоску агара шири­ной около 1 см. Получается два агаровых полудиска в одной чашке. На одну сторону агаровой пластинки засе­вают аэроб, например часто используют S. aureus или Serratia marcescens. На другую сторону засевают ана­эроб. Края чашки заклеивают пластилином или заливают расплавленным парафином и помещают в термостат. При наличии подходящих условий в чашке начнут размно­жаться аэробы. После того, как весь кислород в прост­ранстве чашки будет ими использован, начнется рост анаэробов (через 3—4 сут). В целях сокращения воздуш­ного пространства в чашке питательную среду наливают возможно более толстым слоем.

Комбинированные методы. Основаны на сочетании фи­зических, химических и биологических методов создания анаэробиоза.

14. Питательные среды и их классификация. Требования, предъявляемые к питательным средам

Питательной средой в микробиологии называют среды, содер­жащие различные соединения сложного или простого состава, которые применяются для размножения бактерий или других микроорганизмов в лабораторных или промышленных условиях.

Питательные среды готовят из продуктов животного или рас­тительного происхождения. Большое значение имеет наличие в питательной среде ростовых факторов, которые катализируют метаболические процессы микробной клетки (витамины груп­пы В, никотиновая кислота и др.).

Искусственные среды готовят по определенным рецептам из различных настоев или отваров животного или растительного про­исхождения с добавлением неорганических солей, угле­водов и азотистых веществ.

В бактериологической практике чаще всего используют сухие питательные среды, которые получают на основе достижений современной биотехнологии. Для их приготовления используют экономически рентабельное непищевое сырье: утратившие срок годности кровезаменители (гидролизин—кислотный гидролизат крови животных, аминопептид — ферментативный гидролизат крови; продукты биотехнологии (кормовые дрожжи, кормовой лизин, виноградная мука, белколизин). Сухие питательные среды могут храниться в течение длительного времени, удобны при транспортировке и имеют относительно стандартный состав.

Питательные среды:

Натуральные (более дешёвая, но не воспроизводимая-бульон из мяса)

Искусственные (более дорогая, но воспроизводимая)

По составу среды могут быть:

Простые (ПВ-пиптонная вода, ПБ, МПБ, МПА)

Сложные (КА, СБ)-готовят на основе простых путём добавления определённых в-в.

В зависимости от консистенции:

Жидкие

Полужидкие

Плотные (плотность достигается добавлением агара).

АГАР – полисахарид, получаемый из водорослей. Плавится при t=100^оС, при t=45^оС и ниже-стан-ся более плотным.

В полужидких средах – 0, 5 % агара

В плотных средах – 2 %

В жидких – 0%

По назначению

Универсальные — среды, на которых хорошо растут многие виды патоген­ных и непатогенных бактерий. К ним относятся: мясо-пептонный бульон (МПБ = = мясная вода + 1 % пептона + 0, 5 % NaCl), мясо-пептонный агар (МПА = МПБ + + 2-3 % агара).

Дифференциально-диагностические — среды, позволяющие отличать одни виды бактерий от других по их ферментативной активности или культуральным проявлениям. К ним относятся среды Эндо, Левина, Плоскирева, Гисса и многие др.

Селективные (избирательные, элективные, обогатительные) — среды, со­держащие вещества, используемые микроорганизмами определенных видов и не благоприятствующие или даже препятствующие росту других микроорганизмов. Се­лективные среды позволяют направленно отбирать из исследуемого материала оп­ределенные виды бактерий. Сюда относятся среды Мюллера, селенитовая, Рапо­порт, 1 %-ная пептонная вода и др. среда Чистовича(9% NaCl) только для St.aureus

Дифференциально-селективные — среды, сочетающие в себе свойства диф­ференциально-диагностических и селективных сред. Они используются, в частно­сти, для ускорения обнаружения и идентификации бактерий, относящихся к боль­шому числу широко распространенных видов энтеробактерий и псевдомонад (среды Сиволодского).

Среды обогащения – среды, кот.стимулируют рост 1 м.о., замедляя или подавляя рост другого(селинитовая среда для Сальмонелл)

Специальные — среды, специально приготовленные для получения роста тех бактерий, которые не растут или очень плохо растут на универсальных средах. К ним относятся среды Мак-Коя—Чепина (для получения роста возбудителя туляре­мии), кровяной МПА (для получения роста патогенных стрептококков), среда Ле-венштейна—Иенсена (для выделения возбудителя туберкулеза) и др.

Требования, предъявляемые к пи­тательным средам:

- должна быть стерильна;

- содержать воду;

- для культивирования гетероорганотрофных бакт.среда должна содержать органический источник углерода и энергии (глюкоза, пиптон);

- значение для роста м.о.имеет кислотность среди или рН;

- среда должна обладать определённым осмотическим давлением.

15 - Особенности биологии вирусов

Вирусы — мельчайшие микробы, не имеющие клеточного строения, белоксинтезирующей системы, содержащие только ДНК или РНК. Относятся к царству Vira. Являясь облигатными внутриклеточными паразитами, вирусы размножаются в ци­топлазме или ядре клетки. Они — автономные генетические структуры. Отличаются особым — разобщенным (дисъюнктивным) способом размножения (репродукции): в клетке от­дельно синтезируются нуклеиновые кислоты вирусов и их белки, затем происходит их сборка в вирусные частицы. Сформированная вирусная частица называется вирионом.

Основные свойства вирусов, по которым они отличаются от всех остальных жи­вых существ (кроме плазмид), следующие:

Ультрамикроскопические размеры.

Вирусы содержат нуклеиновую кислоту только одного типа — или ДНК, или РНК. Все другие организмы содержат нуклеиновые кислоты обоих типов, а геном у них представлен только ДНК.

Вирусы не способны к росту и бинарному делению.

Вирусы размножаются путем воспроизводства себя из собственной геномной нуклеиновой кислоты. Размножение всех прочих организмов включает стадии бинарного деления клеток.

У вирусов отсутствуют собственные системы мобилизации энергии.

У вирусов нет собственных белоксинтезирующих систем.

В связи с отсутствием собственных систем синтеза белка и мобилизации энергии вирусы являются абсолютными внутриклеточными паразитами. Средой обитания вирусов являются бактерии, клетки растений, животных и человека.

С учетом перечисленных особенностей вирусам можно дать следующее определе­ние: вирусы — особое царство улътрамикроскопигеских размеров организмов, обладающих только одним типом нуклеиновых кислот, лишенных собствен­ных систем синтеза белка и мобилизации энергии и являющихся поэтому аб­солютными внутриклетогными паразитами (А. И. Коротяев).

Существует и другой взгляд на природу вирусов: «...вирусы можно рассматри­вать как генетигеские элементы, одетые в защитную обологку и способные переходить из одной клетки в другую». Однако эти же авторы там же называют репродукцию вируса в клетке его жизненным циклом.

16 - Структура и химический состав вирусов

Вирусы — мельчайшие микробы, не имеющие клеточного строения, белоксинтезирующей системы, содержащие только ДНК или РНК. Относятся к царству Vira. Являясь облигатными внутриклеточными паразитами, вирусы размножаются в ци­топлазме или ядре клетки. Они — автономные генетические структуры. Отличаются особым — разобщенным (дисъюнктивным) способом размножения (репродукции): в клетке от­дельно синтезируются нуклеиновые кислоты вирусов и их белки, затем происходит их сборка в вирусные частицы. Сформированная вирусная частица называется вирионом.

Морфологию и структуру вирусов изучают с помощью элек­тронного микроскопа, так как их размеры малы и сравнимы с толщиной оболочки бактерий.

Форма вирионов может быть раз­личной: палочковидной (вирус табачной мозаики), пулевидной (вирус бешенства), сферической (вирусы полиомиели­та, ВИЧ), в виде сперматозоида (многие бактериофаги). Различают просто устроенные и сложно устроенные вирусы.

Простые, или безоболочечные, вирусы состоят из нуклеиновой кисло­ты и белковой оболочки, называемой капсидом. Капсид состоит из повторяющихся морфологических субъединиц — капсомеров. Нуклеиновая кислота и капсид взаимодействуют друг с другом, образуя нуклеокапсид.

Сложные, или оболочечные, вирусы снаружи капсида окружены ли-попротеиновой оболочкой (суперкапсидом, или пеплосом). Эта оболоч­ка является производной структурой от мембран вирус-инфицированной клетки. На оболочке вируса расположены гликопротеиновые ши­пы, или шипики (пепломеры). Под оболочкой некоторых вирусов нахо­дится матриксный М-белок.

Капсид и суперкапсид защищают вирионы от влияния окру­жающей среды, обусловливают избирательное взаимодействие (адсорбцию) с клетками, определяют антигенные и иммуногенные свойства вирионов. Внутренние структуры вирусов называ­ются сердцевиной.

Тип симметрии. Капсид или нуклеокапсид могут иметь спираль­ный, икосаэдрический (кубический) или слож­ный тип симметрии. Икосаэдрический тип сим­метрии обусловлен образованием изометричес­ки полого тела из капсида, содержащего вирус­ную нуклеиновую кислоту (например, у вирусов гепатита А, герпеса, полиомиелита). Спираль­ный тип симметрии обусловлен винтообразной структурой нуклеокапсида (например, у вируса гриппа).

Включения — скопление вирионов или отдельных их компонентов в цитоплазме или ядре клеток, выяв­ляемые под микроскопом при специальном окрашива­нии. Вирус натуральной оспы образует цитоплазмати-ческие включения — тельца Гварниери; вирусы герпеса и аденовирусы — внутриядерные включения.

Размеры вирусов определяют с помощью электронной мик­роскопии, методом ультрафильтрации через фильтры с извест­ным диаметром пор, методом ультрацентрифугирования. Одним из самых мелких вирусов является вирус полиомиелита (около 20 нм), наиболее крупным — натуральной оспы (около 350 нм).

Вирусы имеют уникальный геном, так как содержат либо ДНК, либо РНК. Поэтому различают ДНК-содержащие и РНК-содержащие вирусы. Они обычно гаплоидны, т.е. име­ют один набор генов. Геном вирусов представлен различными видами нуклеиновых кислот: двунитчатыми, однонитчатыми, линейными, кольцевыми, фрагментированными. Среди РНК-содержащих вирусов различают вирусы с положительным (плюс-нить РНК) геномом. Плюс-нить РНК этих вирусов выполняет наследственную функцию и функцию информационной РНК (иРНК). Имеются также РНК-содержащие вирусы с отрицатель­ным (минус-нить РНК) геномом. Минус-нить РНК этих виру­сов выполняет только наследственную функцию.

Геном вирусов способен включаться в состав генетического аппарата клетки в виде провируса, проявляя себя генетическим паразитом клетки. Нуклеиновые кислоты некоторых вирусов (вирусы герпеса и др.) могут находиться в цитоплазме инфициро­ванных клеток, напоминая плазмиды.

Тип симметрии. Капсид или нуклеокапсид могут иметь спираль­ный, икосаэдрический (кубический) или слож­ный тип симметрии. Икосаэдрический тип сим­метрии обусловлен образованием изометричес­ки полого тела из капсида, содержащего вирус­ную нуклеиновую кислоту (например, у вирусов гепатита А, герпеса, полиомиелита). Спираль­ный тип симметрии обусловлен винтообразной структурой нуклеокапсида (например, у вируса гриппа).