Главная страница Случайная страница
Разделы сайта
АвтомобилиАстрономияБиологияГеографияДом и садДругие языкиДругоеИнформатикаИсторияКультураЛитератураЛогикаМатематикаМедицинаМеталлургияМеханикаОбразованиеОхрана трудаПедагогикаПолитикаПравоПсихологияРелигияРиторикаСоциологияСпортСтроительствоТехнологияТуризмФизикаФилософияФинансыХимияЧерчениеЭкологияЭкономикаЭлектроника
Секвенирование ДНК (энзиматический метод).
|
|
Секвенирование ДНК - набор биохимических методов установления последовательности нуклеотидных оснований ДНК: аденина, гуанина, цитозина и тимина.
^ МЕТОД СЭНГЕРА
Это наиболее употребительный метод секвенирования ДНК, он позволяет анализировать более крупные фрагменты ДНК с меньшей вероятностью ошибки. Секвенируемую ДНК сначала клонируют в одноцепочечныйбактериофаговый вектор, Одноцепочечная ДНК взаимодействует как субстрат с ДНК-поли-меразой, которая точно копирует первую цепь. Для инициирования этого процесса используют химически синтезированный универсальный нуклеотидный праймер. в результате реакции получаются смеси меченных радионуклидами фрагментов ДНК, один конец у которых одинаков, но при этом они имеют разную длину и разные основания на другом конце.
После инкубации ДНК в каждой смеси превращается в одноцепочечную форму. Затем смеси подвергают электрофорезу в полиакриламидном геле. Длину и последовательность фрагментов ДНК можно считывать непосредственно с гелевого слоя.
96. ^ Секвенирование ДНК (метод хим гидролиза)
В основе метода секвентированияднк путём хим деградации лежит ограниченооеращепление меченого фрагмента днк под действием специфических реагентов. Условие-меченоеднк только по одному концу. Разделениепродуктов деградации по размеру с помощью элетрофореза в полиакриламидном геле, способного разделять фрагменты днк, различающиеся между собой по длине всего на один нуклеотид.
основанный на специфической химической деградации фрагмента ДНК, радиоактивно меченного с одного конца. Препарат меченной ДНК разделяли на четыре аликвоты и каждую обрабатывали реагентом, модифицирующим одно или два из четырех оснований. А. Максам и У. Гилберт предложили модифицировать пуриновые основания диметилсульфатом. При этом происходит метилированиеадениновых остатков по азоту в положении 3, а гуаниновых - по азоту в положении 7. Обработка образца ДНК соляной кислотой при 0°С приводит к выщеплениюметиладенина. Последующая инкубация при температуре 90°С в щелочной среде вызывает разрыв сахарно-фосфатной цепи ДНК в местах выщепления оснований. Обработка пиперидином приводит к гидролизу образца по остаткам метилгуанина. Пиримидиновые основания модифицируют гидразином. Если реакцию вести в бессолевой среде, то модифицируются как цитозин, так и тимидин; если обработку вести в присутствии 2М NaCl, то модифицируется лишь цитозин. Расщепление цепи ДНК на фрагменты и в этом случае осуществляется пиперидином. Условия реакций авторы подбирали таким образом, чтобы в итоге получить полный набор субфрагментов разной длины. Последующий электрофорез в полиакриламидном геле позволяет восстановить полную структуру исследуемого фрагмента.
97 ^. Сравнительный анализ строения гена вирусов, прокариот и эукарио� �.
Главная количественная особенность генетического материала эукариот – наличие избыточной ДНК. Этот факт легко выявляется при анализе отношения числа генов к количеству ДНК в геноме бактерий и млекопитающих. Если средний размер гена бактерий 1500 пар нуклеотидов (п.н.), а длина кольцевой молекулы ДНК хромосомы Е. coli и В. subtilis составляет свыше 1 мм, то в такой хромосоме могут разместиться около 3 тысяч генов. Примерно такое число генов было экспериментально определено у бактерий по числу типов иРНК. Если это число умножить на средний размер гена, то получится, что около 95% генома бактерий состоит из кодирующих (генных) последовательностей. Остальные 5%, по-видимому, заняты регуляторными элементами. Иная картина наблюдается у эукариотических организмов. Например, у человека насчитывают приблизительно 50 тысяч генов (имеется в виду только суммарная длина кодирующих участков ДНК – экзонов). В то же время размер генома человека 3× 109 (три миллиарда) п.н. Это означает, что кодирующая часть его генома составляет всего 15…20 % от тотальной ДНК. Существует значительное число видов, геном которых в десятки раз больше генома человека, например некоторые рыбы, хвостатые амфибии, лилейные. Избыточная ДНК характерна для всех эукариот. В этой связи необходимо подчеркнуть неоднозначность терминов генотип и геном. Под генотипом следует понимать совокупность генов, имеющих фенотипическое проявление, тогда как понятие генома обозначает количество ДНК, находящееся в гаплоидном наборе хромосом данного вида.
^ Организация генома прокариот (на примере кишечной палочки)
Основу генетического аппарата кишечной палочки составляет бактериальная хромосома, входящая в состав нуклеоида – ядерноподобной структуры. Нуклеоид по морфологии напоминает соцветие цветной капусты и занимает примерно 30% объема цитоплазмы. Бактериальная хромосома представляет собой кольцевую двуспиральную правозакрученную молекулу ДНК, которая свернута во вторичную спираль. Длина бактериальной хромосомы составляет примерно 4, 7 млн. нуклеотидных пар (п.н.), или ~ 1, 6 мм. Вторичная структура хромосомы поддерживается с помощью гистоноподобных (основных) белков и РНК. Точка прикрепления бактериальной хромосомы к мезосоме (складке плазмалеммы) является точкой начала репликации ДНК (эта точка носит название OriC). Бактериальная хромосома удваивается перед делением клетки, и сестринские копии распределяются по дочерним клеткам с помощью мезосомы. Репликация ДНК идет в две стороны от точки OriC и завершается в точке TerC. Молекулы ДНК, способные себя воспроизводить путем репликации, называются репликоны.
Геном вирусов включает:
– Структурные гены, которые кодируют белки. Занимают примерно 95 % вирусной хромосомы. Белки вирусов можно разделить на несколько групп: структурные, ферменты, регуляторы.
– Регуляторные последовательности, которые не кодируют белки: промоторы, операторы и терминаторы.
– Прочие некодирующие участки (сайты), в том числе:
– участок attP, обеспечивающий интеграцию вирусной хромосомы в хромосому клетки–хозяина;
– участки cos – липкие концевые участки линейных вирусных хромосом, обеспечивающие замыкание линейной хромосомы в кольцевую форму.
Гены, кодирующие рРНК и тРНК, в геноме вирусов обычно отсутствуют. Однако в геноме крупного фага Т4 имеются гены, кодирующие несколько тРНК.
Геном вирусов отличается высокой плотности упаковки информации. Например, у фага φ Х174 в пределах одного гена может располагаться еще один ген. В частности, ген В находится в пределах гена А, а ген Е – в пределах гена D. У мелкого РНК-содержащего фага f2 ген регуляторного белка, блокирующего лизис (созревание вирионов и разрушение клетки), перекрывается с двумя другими генами, удаленными друг от друга.
98. ^ Мозаичные гены. Интроны. Экзоны.
Диагностировать мозаицизм, который мы ранее обозначили как сочетание клеток с нормальными и аномальными хромосомами, чрезвычайно трудно. Пораженные индивиды весьма различны в зависимости от того, какие органы у них затронуты. Часто встречаются родители, внешне вполне нормальные, которые имеют детей с аномальными половыми хромосомами. один из родителей «мозаичен» по такой же, как у ребенка, хромосомной аномалии, но поскольку клетки его жизненно -важных органов нормальны, он кажется не пораженным болезнью.
Интроны.
Не следует путать с интронизацией — общественным богослужением.
Интрон — участок ^ ДНК, который является частью гена, но не содержит информации о последовательности аминокислот белка.
Последовательность нуклеотидов, соответствующая интрону, удаляется из транскрибированной с него РНК в процессе сплайсинга до того, как произойдёт считывание белка (трансляция). Интроныхарактерны для всех типов эукариотической РНК, но также найдены в рибосомальной РНК (рРНК) и транспортной РНК (тРНК) прокариот. Число и длина интронов очень различны в разных видах и среди разных генов одного организма. Например, геном рыбы фугу (Takifugu rubripes) содержит мало интронов. С другой стороны, гены млекопитающих и цветковых растений часто содержат многочисленные интроны, которые могут быть длиннее экзонов.
Экзон-участок гена, несущий информацию о первичной структуре белка. В гене экзоныразделенынекодирующими участками — интронами.
Или это последовательность ДНК, которая обычно представлена в зрелой РНК. При альтернативномсплайсинге некоторые экзоны удаляются из зрелой РНК.
99. ^ Перекрывающиеся гены.
На одном и том же участке ДНК иногда может быть записана информация о двух совершенно разных РНК и, соответственно, о совершенно разных белках. Такое явление получило название перекрывания генов.
То есть за счёт сдвига рамки считывания трансляция может начинаться с разных нуклеотидных последовательностей. Соответственно, при трансляции мРНК образуются совершенно разные белки.
100. ^ Структура лактозного оперона E. coli, регуляция его генетической активности.
Механизм регуляции генетического кода был открыт французскими учеными ФЖакобом и ЖМоно в 1961 г. на бактериях E.coli и получил название механизма индукции-репрессии. Было установлено, что синтез соответствующих белков - ферментов индуцируется веществом, служащим субстратом для данного фермента и необходимым для нормальной жизнедеятельности клетки.
Так, например, для нормальной жизнедеятельности E.coli необходим молочный сахар (лактоза) и в ее геноме содержатся гены, контролирующие синтез ферментов, гидролизующих лактозу до простых соединений. Если среда, в которой находятся бактерии, лактозы не содержит, эти гены пребывают в репрессированном состоянии и не функционируют. Внесенная в среду лактоза будет тем индуктором, который включает в работу данные гены, и в клетке начинается синтез ферментов, гидролизующих лактозу до более простых соединений. После удаления лактозы из среды синтез этих ферментов прекращается.
Роль репрессора может выполнять и вещество, синтезируемое в клетке, если содержание его превышает норму. Например, если синтезируются нуклеотиды, аминокислоты и другие вещества и содержание их превышает количество, необходимое данной клетке, каждое из них может быть репрессором и подавлять работу генов, синтезирующих ферменты, необходимые для данного биохимического процесса.
По теории Жакоба и Моно, гены, влияющие на синтез определенного фермента или белка, расположены в молекуле ДНК последовательно друг за другом в порядке их влияния на ход реакции синтеза. Такая группа генов называется опероном, а гены, непосредственно кодирующие синтез соответствующих ферментов, называют структурными генами. В начале каждого оперона находится специальный ген — ген оператор. На структурных генах одного оперона обычно образуется одна м-РНК, и эти гены бывают одновременно активны или неактивны. Как правило, структурные гены в опероне находятся в состоянии репрессии.
|
|