Транскрипция генов легких цепей иммуноглобулинов

Один из наиболее хорошо изученных случаев регуляции генов на уровне транскрипции относится к иммуноглобулиновым генам мыши. За последние пять лет были идентифицированы цис· и транс- регуляторные элементы, необходимые для специфической транскрипции этих генов в В-клетках.

Делеционное картирование клонированных генов показало, что промотор легкой цепи иммуноглобулина имеет два критических участка – ТАТА-бокс и передний элемент, называемый «окта»-боксом (Bergman et al., 1984; Parslow et al., 1984). Окта-бокс, названный так потому, что состоит из 8 пар оснований, прочитывается как Α ТТТГЦAT. Он был обнаружен во всех изученных промоторах легких цепей иммуноглобулинов и в очень незначительном числе других сайтов. Промоторы генов тяжелых цепей иммуноглобулинов имеют «инвертированный» окта-бокс, АТГЦАААТ (рис. 12.15). Если окта-бокс помещают с 5'-стороны от глобинового гена, то транскрипция этого гена в клетке миеломы увеличивается в 11-18 раз. Это увеличение наблюдалось только в лимфоидных клетках и не наблюдалось в фибробластах (Wirth et al., 1987).

Последовательность энхансера генов легких цепей иммуноглобулинов расположена внутри первого интрона между последовательностью VJ и последовательностью константной области (Queen, Baltimore, 1983; Bergman et al., 1984). Если эту последовательность транслировать на клонированные глобиновые гены, то эти гены также приобретают способность специфически транскрибироваться в лимфоцитах (Picard, Schaffner, 1984).

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

152 _______________ ГЛАВА 12 _____________________________________________________

	Рис. 12.15. Присутствие эволюционно консервативных окта-боксов в промоторах генов иммуноглобулинов. Окта-бокс тяжелых цепей представляет собой инвертированную форму октамера легких цепей (читать А вместо Т, Ц вместо Г и т. д. в обратном направлении). Правая колонка чисел указывает расстояние от конца окта-бокса до начала первого экзона. (Из Parslow et al., 1984.)

При созревании лимфоцитов в ходе перестроек генов происходит сближение энхансеров и промоторов. Количество ядерных транскриптов с перестроенных генов легких цепей (имеющих сближенные промотор и энхансер) более чем в 16 000 раз превышает количество транскриптов с генов, которые не перестроены (Mather, Perry, 1982). При этом энхансер легких цепей иммуноглобулинов стимулирует свои собственные промоторы в 20 раз эффективнее, чем промоторы вируса SV40 или гена металлотионеина. Это наблюдение предполагает синергизм в специфическом взаимодействии между обоими элементами (Garcia el al., 1986). Перестройки сами по себе еще не обеспечивают активацию генов, поскольку перестроенный ген иммуноглобулина не транскрибируется после введения его в фибробласт или в клетку печени. Для начала его транскрипции необходимо присутствие специфических для клетки транс -регуляторных факторов. В 1986 г. были идентифицированы два фактора, связывающиеся с промотором (Staudt et al., 1986). С целью идентификации небольшой фрагмент ДНК, содержащий окта-бокс, инкубировали в ядерных экстрактах из различных клеток. Затем полученные продукты фракционировали в геле. Если ядерный экстракт не содержал белка, связывающегося с этой ДНК, то небольшой фрагмент ДНК быстро двигался через гель. Однако если какой-либо белок действительно присоединялся к этой ДНК, то ее миграция через гель затруднялась. Этот опыт по сдвигу подвижности (рис. 12.16) показал, что каждое ядро содержит по крайней мере один фактор, способный присоединяться к данному фрагменту ДНК. Кроме того, клетки B-ряда (пре-В-клетки, В-клетки и плазматические клетки) дополнительно содержат еще один фактор, специфически связывающийся с ДНК окта-бокса. Эти ДНК-связывающие белки были изолированы, и белок, специфический

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

__________________ МЕХАНИЗМЫ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ ГЕНОВ __________________________ 153

Рис. 12.16. Определение сдвига электрофоретической подвижности. Ядерные экстракты из клеток В-ряда (пре-В, В и плазматические (ПК) клетки) и из клеток, не относящихся к В-ряду (цервикальные, фибробласты и клеточные линии предшественников эритроцитов), смешивали с небольшим сегментом ДНК, содержащим октамер. После инкубации смесь фракционировали с помощью электрофореза в геле, переносили на нитроцеллюлозный фильтр и гибридизовали с радиоактивной ДНК, комплементарной к последовательности октамера. Если фрагменты, содержащие октамер, остаются несвязанными, то они быстро движутся к концу геля. Во всех ядрах имеется белок, связывающийся с октамером неспецифично и существенно замедляющий миграцию. Помимо этого в ядрах из клеток В-ряда содержится другой белок, который затрудняет миграцию из-за присоединения к последовательности октамера. (Из Staudt et al., 1986; фотография с любезного разрешения D. Baltimore.)

для лимфоцитов, был назван NF-A2. Аналогичные методы были использованы для поиска ядерного белка, характерного для клеток B-ряда и специфически связывающегося с энхансерными последовательностями генов легких цепей иммуноглобулинов (Sen, Baltimore, 1986a; Atchinson, Perry, 1987). Этот белок, обозначенный как NF-κ Β, обнаруживается только в зрелых B-клетках и плазматических клетках, т.е. в единственных известных клетках, синтезирующих иммуноглобулины ¹. Активный NF-κ Β не обнаружен в клетках какого-либо другого типа (в том числе и в пре-В-клетках), а также в линии плазматических клеток, которые утратили способность синтезировать легкую цепь иммуноглобулинов. Активный белок NF-κ Β появляется тогда, когда пре-В-клетки индуцируются к образованию В-клеток.

Эти наблюдения поднимают проблему дифференциальной активности генов на другой уровень: что именно контролирует синтез специфических для B-клеток белков – промоторсвязывающего белка NF-A2 и энхансерсвязывающего белка NF-ϰ В? (Иными словами, чтобы объяснить, как осуществляется специфический для клеток синтез иммуноглобулинов, мы должны теперь объяснить, как эти два ядерных белка синтезируются специфическим для клеток образом.) Оказалось, что белок NF-κ Β в неактивной форме содержится в клетках многих типов, но модифицироваться в активную форму он может только в B-клетках. Когда пре-В-клетки искусственно стимулируются к образованию В-клеток, активный NF-κ Β появляется даже в отсутствие белкового синтеза (Sen, Baltimore, 1986b). Природа модификации этого белка остается неизвестной.

Анализ специфической для клеток транскрипции генов легкихцепей иммуноглобулинов вышел в итоге за уровень исследования продуктов терминальной дифференцировки клеток. Мы знаем, что транскрипция этого иммуноглобулинового гена зависит от исходной активности двух ядерных белков, NF-A2 и NF-κ Β, которая наблюдается только в клетках B-ряда. Остается выяснить, каким образом вызывается дифференциальная экспрессия этих двух генов в развивающемся лимфоците.

Исследование иммуноглобулинового энхансера дало объяснение и другим биологическим явлениям. Ниже (т. 3. гл. 20) мы обсудим вопрос о том, что

¹ В пре-В-клетке синтезируется только тяжелая цепь иммуноглобулинов и не синтезируется легкая. Вызывает удивление присутствие неспецифического белка, связывающегосяс окта-боксом, в клетках, не относящихся к В-ряду. Оказалось, что ген гистона Н2В имеет в своем энхансере окта-бокс, и присоединение неспецифическою белка, связывающегося с окта-боксом, определяет время его экспрессии, благодаря чему этот ген транскрибируется в течение S-фазы клеточного цикла (Roeder, 1987; Fletcher et al., 1987).

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

154 _______________ ГЛАВА 12 _____________________________________________________________________________

лимфоцитарные опухоли возникают, когда обычный ген фактора ростапереносится в область иммуноглобулиновогоэнхансера, благодаря чему ген фактора роста транскрибируется по времени и по количествукак антитела. Кроме того, быстрое размножение вируса СПИда, HIV-1, объясняется тем, что он имеет энхансер, очень похожий на энхансер легких цепей иммуноглобулинов. Когда этот вирус инфицирует Т-лимфоцит, он способен индуцировать образование активного NF-κ Β (Sen, Baltimore, 1986b).

Дополнительные сведения и гипотезы: Модульные гены

В 1978 г. Уолтер Гилберт предложил радикальную гипотезу для объяснения существования интронов. Он предположил, что эукариотический геном состоит из модульных единиц, что позволяет «смешивать и сочетать» части. Экзоны кодируют функциональные домены белков и могут сортироваться в ходе эволюции независимо. В 1979 г. начали появляться первые данные в пользу этой гипотезы. Структура тяжелой γ -цепи иммуноглобулина состоит из пяти доменов, каждый из которых имеет специфическую функцию. Домен СНЗ участвует во взаимодействиях поверхностей клеток, домен СН2 присоединяет молекулы комплемента, шарнирный домен позволяет изгибаться антигенсвязывающим сайтам, домен СН1 присоединяется к легкой цепи, а домен вариабельной области формирует антигенсвязывающий сайт. Каждый из этих доменов кодируется отдельным экзоном (рис. 12.17) (Sakano et al., 1979). Функциональные домены ряда белков, в том числе глобинов, кристаллинов хрусталика и белков клеточного узнавания большого комплекса тканевой совместимости, также отражают расположение своих экзонов (Inana et al., 1983; Gilbert, 1985).

Рис 12.17. Соотношение между экзонами гена и доменами глобулярного белка для тяжелой цепи IgG. Каждый домен белка кодируется отдельным экзоном. (Данные из Sakano et al., 1979.)

Рецептор липопротеина низкой плотности (ЛНП) предоставил первое свидетельство перемешивания экзонов которое предполагает, что экзоны могут дуплицироваться в одном гене и затем рекрутироваться для использования в другом гене. Ген этого белка был секвенирован (что оказалось непростым делом, так как он содержит 18 экзонов), и было проведено сравнение его последовательности с другими генами и с функциональными доменами ЛНП-рецептора (Sü dhof et al., 1985). Оказалось, что участок из 400 аминокислот в ЛНП-рецепторе кодируется восемью соседними экзонами, которые очень похожи на восемь экзонов гена фактора роста эпидермиса. В этом же гене был обнаружен еще один домен ЛНП-рецептора размером в 40 аминокислот. Помимо этого ген ЛНП-рецептора содержит серию экзонов, общих с геном белка С9 комплемента (рис. 12.18). Таким образом, ген ЛНП-рецептора оказывается мозаикой из экзонов, полученных из нескольких различных источников.

Если экзоны могут быть перемещены в новые гены, не могут ли быть перемещены также и энхансеры? Вопрос этот крайне важен, поскольку многие зволюционные события можно было бы объяснить изменением времени или места экспрессии генов. Эта гипотеза проверялась на гавайских видах дрозофилы (Rabinow, Dickinson, 1986). Видообразование у этих мух идет с исключительно высокой скоростью, и несколько видов обнаруживают различия в тканевой специфичности экспрессии генов. Например, у личинки D. hawaiiensis ген алкогольдегидрогеназы (АДГ) экспрессируется в жировых телах и каркасе, тогда как у личинки D.formella ген алкогольдегидрогеназы экспрессируется только в жировых телах. Оба фермента можно различить с помощью электрофореза. Эти виды можно спарить друг с другом и получить гибридные личинки. Когда были исследованы жировые тела этих личинок, в них были обнаружены оба фермента АДГ специфичный для D. hawaiiensis и специфичный для D.formella. Однако при анализе каркаса был обнаружен белок только из D.hawaiiensis. Такое распределение можно ожидать, если гены АДГ контролируются цис- регуляторными элементами, которые различаются у этих двух близкородственных видов. (Если бы экс-

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

МЕХАНИЗМЫ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ ГЕНОВ 155

Рис 12.18. Модульная структура доменов рецептора ЛНП. Шесть доменов белка показаны в виде прямоугольников, кодирующие их экзоны обозначены цифрами между стрелкаминад картой белка. Области, гомологичные другим группам экзонов, указаны под картой. (Из Sü dhof et al., 1985)

прессия определялась транс- регуляторными элементами, то оба гена были бы либо включены, либо выключены.) Это наблюдение свидетельствует о том, что энхансеры могут меняться в ходе эволюции, благодаря чему в различных тканях будут синтезироваться различные продукты.