ДНК- и РНК-блоттинг

ДНК-блоттинг (называемый также Саузерн-блоттингом или гибридизацией по Саузерну) представляет собой метод для выявления определенного гена (Sauthern, 1975) с последующим изучением его функций. С помощью ретровирусного вектора ген фактора, стимулирующего образование колоний гранулоцитов и макрофагов (КСФ-г, м). Вводили в клетки, которые в обычных условиях не синтезируют этот фактор, но чувствительны к нему (Lang et al., 1985). Некоторые из клеток, обработанных рекомбинантным вирусом, начинали неконтролируемый рост, образуя после пересадки в мышь злокачественные опухоли. Получили ли все эти клетки дополнительные копии гена КСФ-г, м? Транскрибируют ли эти дополнительные гены мРНК для КСФ-г, м? На первый из этих вопросов ответ был получен с помощью ДНК-блоттинга.

Ланг и его коллеги выделяли ДНК из клеток полученных злокачественных колоний и обрабатывали ее рестриктазой. Затем фрагменты ДНК разделяли с помощью электрофореза в геле. Помещая гель с фрагментами ДНК в раствор щелочи, добивались денатурации ДНК до отдельных цепей. После нейтрализации гель переносили на влажную фильтровальную бумагу на подложке из пластика (рис. 10.9). Нитроцеллюлозный фильтр (способный связывать одноцепочечную ДНК) помещали прямо на гель и накрывали его несколькими слоями бумажных полотенец. Края фильтровальной бумаги, лежащей под гелем, были опущены в сосуд с буфером высокой ионной силы. Буфер поднимался через гель и далее через нитроцеллюлозный фильтр и полотенца. При этом ДНК задерживалась на нитроцеллюлозном фильтре). После запекания ДНК на фильтре (иначе произойдет ее утечка) фрагменты

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

ТОЖДЕСТВО ГЕНОМОВ И ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ 89

Рис. 10.9. Аппарат для Саузерн-блоттинга. Буфер для переноса проходит через гель, нитроцеллюлозу и бумажные полотенца благодаря капиллярному эффекту, захватывая с собой ДНК. Одноцепочечная ДНК задерживается нитроцеллюлозным фильтром. Положение ДНК на фильтре отражает положение фрагментов ДНК в геле.

ДНК инкубировали с радиоактивной кДНК к соответствующему гену (можно использовать также и мРНК). Радиоавтограф нитроцеллюлозного фильтра показал, где радиоактивная ДНК нашла себе комплементарную ДНК. В итоге Лaнг с коллегами показали (рис. 10.10), что помимо двух обычных генов мыши, продуцирующих КСФ-г, м и расположенных в рестрикционном фрагменте длиной 7800 пар оснований, злокачественные клетки имеют ген КСФ-г, м, полученный от вируса (о чем свидетельствует наличие последовательностей вирусной ДНК) и лежащий в рестрикционном фрагменте длиной 5500 пар оснований. Для каждого из клонов злокачественных клеток был получен аналогичный результат.

Экспрессию этих генов можно продемонстрировать с помощью РНК-блота (обычно называемого Нозерн-блотом). В отличие от Саузерн-блота, при котором из геля на бумагу переносят ДНК, при Нозерн-блоте (название не связано с фамилией исследователя) аналогичным образом из геля на бумагу переносят РНК. Нозерн-блоты весьма полезны при изучении накопления специфических мРНК в цитоплазме определенной клетки. В данном случае цитоплазматическую РНК изолируют из злокачественных клеток, инфицированных ретровирусом, содержащим ген КСФ-г, м, и из незлокачественных клеток, инфицированных аналогичным ретровирусом, но лишенным гена КСФ-г, м. РНК из каждого клеточного клона фракционировали в геле и переносили на нитроцеллюлозный фильтр. После инкубации фильтра с кДНК к гену КСФ-г, м было обнаружено, что во всех злокачественных клонах транскрибируется ген КСФ-г, м. Другие клетки его не транскрибируют (рис. 10.11). Ланг с соавторами пришли к выводу, что в клетках транскрибируется искусственно выделенный ген КСФ-г, м, находящийся под контролем вируса. Далее оказалось, что эти клетки, которым требуется КСФ-г, м для роста, приобрели способность синтезировать свой собст-

•

Рис. 10.10. Интеграция ретровируса, содержащего ген КСФ-г, м, в геном клетки мыши. Представлены результаты гибридизации по Саузерну (блот) геномов из 20 клонов. ДНК была выделена из каждого клона, обработана рестриктазой Sac 1, разделена в геле, подвергнута блоттингу и гибридизована с радиоактивной кДНК к гену КСФ-г, м. Дорожки 2–19 содержат ДНК из злокачественных клеток, инфицированных ретровирусом, содержащим ген КСФ-г, м. Дорожка 1 содержит ДНК из незлокачественного клона, инфицированного аналогичным вирусом без гена КСФ-г, м; дорожка 20 содержит ДНК из неинфицированных зародышей мыши. Верхние зоны представляют ген КСФ-г, м из нормального генома мыши. Нижние зоны представляют ген КСФ-г, м, введенный вирусом. (Из Lang et al., 1985; фотография с любезного разрешения R. A. Lang.)

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

90 ГЛАВА 10

Рис. 10.11. Обнаружение вирусоспецифических мРНК. кодирующих КСФ-г, м. Представлены результаты Нозерн-блоттингамРНК из 8 клонов клеток, инфицированных ретровирусом, содержащим ген КСФ-г, м мыши (дорожки 2–9), и двух клонов, инфицированных аналогичным вирусом, лишенным ДНК гена КСФ-г, м (дорожки 10 и 11). Транскрипт, кодируемый вирусом, содержит больше РНКв лидерной последовательности между сайтами инициации транскрипции и трансляции. Поэтому он превосходит по размерам обычную КСФ-г, м мРНК мыши (дорожка 1 ) и остается в верхней части геля. (Из Lang et al., 1985. Фотография с любезного разрешения К. А. Lang.)

Рис. 10.12. Нозерн-блот для гена алкогольдегидрогеназы в процессе развития Drosophila melanogaster. Хромосомная локализация этого гена показана на рис. 9.1. РНК экстрагировали на стадиях зародыша (Е), личинки (L), предкуколки (РР) куколки (Р), имаго (А) и затем равные количества (5 мкг) вносили в карманы геля. После электрофореза РНК переносили блоттингом на нитроцеллюлозный фильтр и инкубировали в растворе, содержащем одноцепочечный фрагмент ДНК гена алкогольдегидрогеназы. Нозерн-блот показывает, что в ходе эмбриогенеза накапливается незначительное количество РНК этого гена, тогда как в тканях личинки происходит значительное увеличение количества мРНК алкогольдегидрогеназы. Когда личинки начинают окукливаться, в них прекращается накопление этой мРНК. Однако у взрослых особей отмечается высокое содержание этой мРНК. (Из Savakis, Ashburner, 1985.)

венный КСФ-г, м. Таким образом, они стимулируют себя к непрерывному делению, образуя в конечном счете опухоли. [Это наблюдение подтверждало гипотезу Тодаро и др. (Todaro et al., 1977), которые предсказали подобный феномен в 1977 г. Эти опыты по индукции опухолей будут подробно рассматриваться в гл. 20.]

Одним из важных применений Нозерн-блота является определение времени начала экспрессии какого-либо конкретного гена. Исследователь может выделить препараты РНК из зародышей на различных стадиях развития и разделить их с помощью электрофореза на параллельных дорожках геля. После переноса расфракционированной РНК на нитроцеллюлозный фильтр методом блоттинга фильтр со связанной РНК инкубируют в растворе, содержащем радиоактивный одноцепочечный фрагмент ДНК исследуемого гена. Эта ДНК будет связываться только с теми участками, где находится комплементарная РНК. Таким образом, если мРНК для данного гена присутствует на определенной стадии эмбриогенеза, то радиоактивная ДНК должна связываться с ней и ее можно зарегистрировать с помощью радиоавтографии. Радиоавтографы этого типа называют Нозерн-блотами развития. На рис. 10.12 показан Нозерн-блот развития для экспрессии гена алкогольдегидрогеназы у Drosophila. Можно видеть, что мРНК для этого белка синтезируется на всех стадиях зародышевого развития, кроме стадии куколки, и у взрослой особи (Savakis, Ashburner, 1985).