Секвенирование

Результаты секвенирования дают нам представление о структуре кодируемого белка и позволяют идентифицировать регуляторные последовательности ДНК, общие для ряда генов. (Например, в следующей главе мы увидим, что все гены, регулируемые гормоном прогестероном, содержат почти одинаковые последовательности ДНК вблизи начала участков, кодирующих белок.) Простота метода секвенирования с д₂НТФ (Sanger et al., 1977) сделала этот метод обычным для многих молекулярно-биологических лабораторий. С использованием фага или плазмиды, несущих клонированный ген, выделяют одну цепь кольцевой ДНК (рис. 10.4). Затем гибридизуют радиоактивную ДНК-затравку (примерно из 20 нуклеотидов), которая комплементарна фаговой ДНК в области, непосредственно примыкающей к 5’-концу клонированного гена. (Так как эти последовательности известны, олигонуклеотидные затравки могут быть легко синтезированы или получены из коммерческих источников.) Затравка имеет свободный 3’-конец, к которому можно добавить дополнительные нуклеотиды. ДНК с затравкой и все четыре дезоксирибонуклеозидтрифосфата помешают в четыре пробирки. Каждая из пробирок содержит полимеризующую субъединицу ДНК-полимеразы и один из дидезоксирибонуклеозидтрифосфатов: одна пробирка содержит дидезокси-Г, другая - дидезокси-А и т. д. Структура дезокси- и дидезоксинуклеотидов представлена на рис. 10.5. Если дезоксинуклеотид лишен гидроксильной (ОН) группы при атоме углерода в 2-положении сахара, то дидезоксинуклеотид лишен гидроксильных групп при атомах углерода в двух положениях 2' и 3'. Поэтому, хотя дидезоксинуклеотид может присоединяться ДНК-полимеразой к растущей цепи ДНК, он останавливает дальнейший рост цепи, поскольку из-за отсутствия 3'-гидроксильной группы к нему не может присоединиться новый нуклеотид. Если ДНК-полимераза синтезирует ДНК от затравки, то новообразованная ДНК будет комплементарна клонированному гену. В пробирке с дидезокси-А каждый раз, когда ДНК-полимераза присоединяет А к растущей цепи, существует возможность, что вместо дезокси-А будет присоединен дидезокси-А. В том случае, когда это происходит, рост цепи останавливается. Аналогичным образом в пробирке с дидезокси-Г рост цепи с некоторой вероятностью останавливается каждый раз, когда присоединяется Г. (Все это напоминает греческий народный танец, где лишь небольшая группа из потенциальных танцоров одновременно участвуют в танце.) Поскольку в каждой пробирке синтезируются миллионы цепей, каждая пробирка будет содержать популяцию цепей, синтез которых остановлен в первом из возможных положений, в последнем и, наконец, в промежуточных положениях. Например, пробирка с дидезокси-А будет содержать

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

Рис. 10.4. Метод секвенирования ДНК с использованием дидезоксинуклеотидов.

Рис. 10.5. Сравнение дезокси- и дидезоксинуклеотидов. А. Структуры нуклеотидов обоих типов. Б. З'-конец цепи, которая была терминирована включением дидезоксинуклеотида, поскольку он не содержит 3’-гидроксильную группу, необходимую для дальнейшей полимеризации ДНК.

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

ТОЖДЕСТВО ГЕНОМОВ И ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ 87

Рис 10.6. Пример секвенирования ДНК с помощью дидезокси-метода. (С любезного разрешения О. Guild.)

цепи различной дискретной длины, каждая из которых оканчивается остатком А.

Полученные радиоактивные фрагменты ДНК разделяют с помощью электрофореза Смеси фрагментов вносят в лунки на одной стороне геля и затем пропускают через гель электрический ток. Отрицательно заряженные фрагменты ДНК мигрируют в направлении положительного полюса, при этом меньшие по размеру фрагменты движутся быстрее, чем крупные. Фрагменты с наименьшим числом нуклеотидов движутся быстрее, чем фрагменты с большим числом нуклеотидов (рис. 10.4 и 10.6). Прочитывая наборы полос, определяют последовательность ДНК, комплементарную клонированному гену.