Поздние реакции

Повышения содержания свободных ионов кальция недостаточно для осуществления всех реакций оплодотворения. Оно сочетается с повышением внутриклеточного pH. Полагают, что сочетание этих двух условий (высокое содержание Са⁺ и низкий pH) приводит к осуществлению полного спектра явлений оплодотворения, включая белковый синтез и синтез ДНК (Winkler et al.. 1980: Whitaker, Steinhardt. 1982). Повышение внутриклеточного pH начинается в то время, когда наблюдается вторичное поступление ионов натрия в яйцо и обмен между ионами натрия из морской воды и ионами водорода из яйца в отношении 1: 1. В яйце морского ежа обмени-

Рис. 2.33. Синтез белка в яйцах морского ежа сразу же после оплодотворения. Включение [14С]- лейцина в белки неоплодотворенных (темные кружки) и оплодотворенных (светлые кружки) яиц. (По Epel. 1967.)

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. I: Пер. с англ. — М.: Мир, 1993. — 228 с.

_______________ ОПЛОДОТВОРЕНИЕ ВОЗНИКНОВЕНИЕ НОВОГО ОРГАНИЗМА 65

Рис. 2.34. Двойной ионный контроль белкового синтеза при оплодотворении. А. Повышение pH цитоплазмы при помощи аммония. Непрерывная регистрация вутриклеточного pH после помещения яиц в воду с разным содержанием NH4CI. Б.. Оценка величины белковою синтеза по включению радиоактивного валина в белки при определенных ионных условиях Повышение pH тормозилось при оплодотворении яиц в безнатриевой морской воде и при добавлении в воду ионов аммония. Увеличение концентрации свободного кальция подавлялось ЭΓ Τ А и возрастало при воздействии Α 23187. (А - по Shen. Steinhardt. 1978; Б - по Winkler el al.. 1980.)

вается около 75% ионов водорода. Утрата такого количества ионов водорода приводит к повышению pH с 6.8 до 7.2 и к глубоким изменениям физиологии яйца (Shen, Steinhurdt. 1978). Принято считать, что эти изменения обусловлены кальций-зависимой реакцией, однако было обнаружено, что многие из поздних реакций оплодотворения могут вызываться повышением внутриклеточного pH любым способом. Поздние реакции оплодотворения включают активацию синтеза ДНК и белкового синтеза. Резкое повышение белкового синтеза обычно происходит через несколько минут после проникновения спермия и не зависит от синтеза новых мРНК (рис. 2.33). При синтезе новых белков, вероятно, используются мРНК, уже содержащиеся в цитоплазме ооцита. (Более подробно этот вопрос обсуждается в гл. 14.) Подобное скачкообразное увеличение интенсивности белкового синтеза можно вызвать искусственно, помещая неоплодотворенные яйца в раствор, содержащий ионы аммония (Winkler et al., 1980). Эти ионы теряют протоны вне клетки и диффундируют через плазматическую мембрану в виде NH₃; проникнув в клетку, они присоединяют протоны и превращаются в NH⁺₄. Отражением происходящей при этом утраты свободных ионов водорода является повышение внутриклеточного pH (рис. 2.34). Таким образом, ионы аммония способны повысить pH цитоплазмы без участия в этом процессе обмена между ионами натрия и водорода При этом они активируют белковый синтез и синтез ДНК.

Противоположное действие оказывают агенты, блокирующие повышение pH: одновременно они блокируют поздние события оплодотворения. Если яйца сразу после оплодотворения поместить в морскую воду с низким содержанием ионов натрия или если в морскую воду добавить амилорид (вещество, подавляющее транспорт ионов натрия в клетку), то белковый синтез не активируется, женский и мужской пронуклеусы не перемещаются, деления клетки не происходит (Dube et al.. 1985).

Дополнительные сведения и гипотезы: Биохимия активации яйца

У морских ежей и позвоночных животных активацию яйца вызывает волна выхода ионов кальция из внутриклеточных депо, таких, как эндоплазматический ретикулум. У морского ежа Arbacia punctuluta повышение внутриклеточной концентрации свободных ионов кальция впервые обнаруживается через 20-30 с после прикрепления спермия к яйцу, одновременно с инициацией экзоцитоза кортикальных

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. I: Пер. с англ. — М.: Мир, 1993. — 228 с.

66 ГЛАВА 2

Рис. 2.35. Схема инициации ионных потоков при оплодотворении. Когда спермий прикрепляется к своему рецептору на плазматической мембране яйца, рецептор активирует белок, связывающий ГТФ (белок G), который в свою очередь активирует фосфолипазу С Фосфолипаза С расщепляет фосфатидилинозитол-4.5-бисфосфат на диацилглицерол и инозитолтрисфосфат (ИТФ). ИТФ вызывает выход Са⁺ из эндоплазматического ретикулума, тогда как диацилглицерол активирует протеинкиназу С. Под действием этой протеинкиназы начинает функционировать Na⁺/ H⁺-насос, в результате чего происходит обмен водородных ионов яйца на внеклеточные ионы натрия: таким образом повышается внутриклеточный pH. (Сходная схема, приводимая в гл. 20. была предложена для начала опухолевого роста.)

гранул (Eisen. Reynolds, 1985). Что же происходит в течение этих 25 с. что приводит к высвобождению связанных ионов кальция?

Исследования последних лет свидетельствуют о том, что прикрепление спермия к плазматической мембране яйца запускает ряд реакций, осуществляющихся с помощью заключенных в мембране ферментов. Эти ферменты синтезируют вещество, способное диффундировать в цитоплазму. Таким веществом, как было показано, является инозитол-1, 4, 5-трисфосфат (ИТФ), вызывающий высвобождение связанного кальция в клетках разного типа (Вeгridge,. 1985: Swann. Whitaker. 1986). В яйцах морского ежа сразу после оплодотворения синтез ИТФ возрастает (Ciapa, Whitaker. 1986). Образование ИТФ сопровождается выходом ионов кальция. Инъекции ИТФ непосредственно в яйца морского ежа и лягушки вызывают высвобождение ионов кальция и кортикальную реакцию (Whitaker, Irvine, 1984; Busa et al., 1985). Процесс выхода кальция из внутриклеточных депо при этом неотличим от реакции, наблюдаемой при нормальном оплодотворении. Кроме того, эти ИТФ-зависимые эффекты можно предотвратить, инъецируя в неоплодотворенные яйца вещества, образующие хелаты кальция (Turner et al.. 1986): это подтверждает представление о том, что ИТФ вызывает выход кальция из внутриклеточных депо.

Ферментом, ответственным за синтез ИТФ, является фосфолипаза С. Этот фермент, входящий в состав плазматической мембраны, расщепляет фосфатидилинозитол-4, 5-бисфосфат на диацилглицерол и ИТФ (рис. 2.35). Если ИТФ вызывает выход кальция из внутриклеточных депо, то диацилглицерол,

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. I: Пер. с англ. — М.: Мир, 1993. — 228 с.

_______________ ОПЛОДОТВОРЕНИЕ: ВОЗНИКНОВЕНИЕ НОВОГО ОРГАНИЗМА 67

по-видимому, активирует другой содержащийся в мембране фермент, протеинкиназу С, которая в свою очередь активирует Na⁺, H⁺-переносчик, осуществляющий обмен ионов натрия на ноны водорода (Swann, Whitaker. 1985: Shen. Burgart. 1986). Таким образом, расщепление фосфатидилинозитол-4, 5-бисфосфата может вызвать как волну высвобождения кальция, так и повышение внутриклеточного pH — два процесса, необходимые для активации яйца и его деления.

Но почему прикрепление спермия к яйцу приводит к образованию ИТФ и диацилглицерола? Имеются данные, что в некоторых клетках-мишенях гормонов соединение рецептора гормона с фосфолипазой С опосредовано белком, связывающим ГТФ (Gбелок, см. Berridge. 1985).

Тернер и др. (Turner et al.. 1986) показали, что то же самое происходит, по-видимому, в случае яиц морского ежа. Когда в яйцо инъецировали аналог ГТФ, стабилизирующий G-белок в активной конфигурации, кортикальные гранулы выделяли свое содержимое в отсутствие спермия. Если же в яйцо инъецировали конкурирующий ингибитор ГТФ, то вызываемый спермием нормальный процесс экзоцитоза кортикальных гранул подавлялся. Это подавляющее действие можно было предотвратить, инъецируя в неоплодотворенное яйцо ИТФ. Схема начальных биохимических событий при активации яйца представлена на рис. 2.32 и 2.35. Прикрепление спермия к неидентифицированному рецептору на плазматической мембране яйца изменяет конформацию этого рецептора таким образом, что он активирует G-белок. G-белок в свою очередь активирует фосфолипазу С, которая расщепляет фосфатидилинозитол-4, 5-бисфосфат на два внутриклеточных посредника, диацилглицерол и инозитолтрисфосфат. Диацилглицерол активирует протеинкиназу С; последняя фосфорилирует белок-переносчик Na⁺ и H⁺, тем самым делая его способным функционировать (при стимуляции ионами кальция), что приводит к повышению внутриклеточного pH. Поскольку ИТФ вызывает выход кальция из эндоплазматического ретикулума, диффузия ИТФ приводит к распространению волны выхода кальция по всему кортикальному слою яйца. Таким образом, прикрепление спермия к плазматической мембране вызывает определенные изменения внутри яйца.