Анализ сырья, содержащего флавоноиды

Физико-химические свойства

Большинство флавоноидов – твердые кристаллические вещества, окрашенные в желтый цвет (флавоны, флавонолы, халконы, ауроны) или бесцветные (катехины, лейкоантоцианидины, флаваноны, изофлавоны). Наиболее яркие окраски свойственны антоцианам, которые придают растительным тканям красную, синюю или фиолетовую окраску. Гликозилированные формы, как правило, хорошо растворимы в воде, нерастворимы или мало растворимы в органических растворителях (хлороформ, эфир, бензол и др.). Агликоны хорошо растворяются в низших спиртах (метиловом и этиловом), ацетоне, этилацетате и в растворах щелочей.

О-гликозиды при действии минеральных кислот (1-5% растворы) и ферментов более или менее легко гидролизуются до агликона и углеводного остатка. С-гликозиды с трудом расщепляются лишь при действии крепких кислот (концентрированная HCl или СН₃СЩЩР) или их смесей при длительном нагревании.

Катехины и лейкоантоцианидины легко окисляются в присутствии кислорода, под действием света и щелочей, превращаясь в окрашенные соединения – продукты конденсации, вплоть до высокомолекулярных форм. Остальные флавоноиды более устойчивы к окислению.

Распространение флавоноидов в природе

В целом флавоноиды чрезвычайно широко распространены в растительном мире. Чаще всего они накапливаются в надземных частях растений (в листьях, цветках и плодах). Наиболее часто встречаются в растениях флавонолы (кемпферол, кверцетин, изорамнетин), флавоны (апигенин, лютеолин и их производные) и антоцианидины (гликозиды цианидина, дельфинидина и пеларгонидина). Ограниченно распространены изофлавоны, ауроны и халконы. Например, изофлавоны обнаружены в представителях семейств бобовых (подсемейство Papiloinoideae), ирисовых, розоцветных, подокарповых, а ауроны и халконы характерны главным образом для видов сем. астровых, бобовых и др.

Лейкоантоцианидины в основном встречаются в древесных растениях, где они наряду с катехинами служат предшественниками конденсированных дубильных веществ (в представителях семейств березовых, буковых, ивовых, чайных, гречишных, розоцветных, в порядках папоротниковые и хвойные).

С-гликозиды наиболее часто встречаются в некоторых родах сем. бобовые, гвоздичные и розоцветные, хотя в целом распространены значительно реже, чем О-гликозиды.

Анализ сырья, содержащего флавоноиды

Для флавоноидов не существует универсального метода выделения из растительного сырья, так как они существенно различаются по своей растворимости в воде и органических растворителях. Наиболее часто применяют избирательную экстракцию, осаждение солями тяжелых металлов и хроматографические методы.

Для удаления из сырья липофильных веществ его обрабатывают петролейным эфиром или хлороформом. Затем проводят экстракцию флавоноидов одним из подходящих растворителей: этанолом или метанолом различной концентрации, бутиловым спиртом или этилацетатом. Извлечения упаривают под вакуумом при температуре не выше 40-70⁰ С и очищают с помощью колоночной хроматографии или другим методом.

Качественные реакции на производные флавона.

1. Цианидиновая проба (проба Шинода).

Она основана на восстановлении водородом карбонила пиронового кольца и образовании антоцианидинов, окрашивающихся в кислой среде от оранжевого до малиново-красного цвета.

Методика. К спиртовому извлечению из сырья добавляют несколько капель конц. хлористоводородной кислоты и 20-30 мг порошка магния или цинка. При наличии флавоноловых веществ наступает окрашивание. Реакцию дают флавоны, флавонолы и флаваноны.

Халконы, ауроны и изофлавоны этой реакции не дают. При наличии халконов, ауронов и антоцианов красное окрашивание наступает от прибавления одной соляной кислоты, поэтому нужен контрольный опыт.

Химизм реакции:

2. Реакции комплексообразования (с солями алюминия, свинца, железа, борной кислотой и др.).

а) комплексные соединения с 1-2% спиртовым раствором хлористого алюминия имеют желтое или желто-зеленое окрашивание

Этой реакцией можно доказать гидрокси-группы при С₃ и С₅. Флавоны и изофлавоны этой реакции не дают.

б) Борно-лимонная проба (реактив Вильсона). В присутствии борной и лимонной кислоты взаимодействуют 5-гидроксифлавоны и 5-гидроксифлавонолы с образованием комплексов ярко-желтой окраски.

в) С 10% раствором ацетата свинца флавоноиды образуют от желтого до оранжево-красного цвета осадки или интенсивно окрашенные лаки. Основной ацетат свинца (свинцовый уксус) реагирует со всеми соединениями, а со средним ацетатом свинца флавоноиды с о-диоксигруппировкой в кольце В.

г) С солями 3-хвалентногот железа флавоноиды, имеющие два гидроксила в орто-положении в кольце В, дают зеленое окрашивание;

если в кольце В три гидроксила в положениях 3’, 4’ и 5’, то образуется черно-синее окрашивание.

3. Реакция азосочетания. В качестве реактива используют свежеприготовленный раствор диазотированного сульфаниламида. В присутствии флавоноидов появляется красное, оранжево-красное или желто-коричневое окрашивание (азокраситель). Соль диазония присоединяется при С₆ или С₈ кольца А.

4. Со щелочами или карбонатами производные флавона дают желтую окраску, переходящую в коричневую; халконы, ауроны – красную окраску; антоцианы – синюю.

Для обнаружения халконов используют реакцию с о SbCl₅ – красное, красно-фиолетовое окрашивание; катехинов и лейкоантоцианидинов – с 1% раствором ванилина и конц. хлористоводородной кислотой – красное окрашивание.

С целью обнаружения флавоноидов в растительном сырье широко используется бумажная и тонкослойная хроматография. Обнаруживают вещества на хроматограммах после их просматривания в УФ-свете. При этом флавоны, флавонол-3-гликозиды, флаваноны и халконы проявляются в виде темно-коричневых пятен. Свободные флавонолы и их 7-гликозиды флюоресцируют желтым или зеленовато-желтым светом. Антоцианы имеют в УФ-свете оричневую или черную окраску, а в видимом свете – розовую, красную или красно-фиолетовую. Халконы и ауроны в УФ-свете флюоресцируют желтым или оранжевым светом, а катехины и лейкоантоцианидины – не обнаруживаются.

Для проявления веществ на хроматограммах часто используют реактивы: пары аммиака, 5% спиртовой раствор хлористого алюминия, растворы хлорного железа, карбонаты натрия и другие.

Количественное определение флавоноидов

Единого метода для всех флавоноидов нет. Применяются следующие методы:

1. Спектрофотометрические методы, основанные на способности флавоноидов поглощать свет в УФ-области спектра, получили наибольшее распространение в настоящее время.

2. Фотоколориметрические методы основаны на реакциях окрашивания с алюминия хлоридом, хлорокисью циркония, борно-лимонным реактивом, с диазотированными растворами слуьфаниламидов и другие.

Реже используют другие методы: флюориметрический, полярографический и весовой.