Студопедия

Главная страница Случайная страница

Разделы сайта

АвтомобилиАстрономияБиологияГеографияДом и садДругие языкиДругоеИнформатикаИсторияКультураЛитератураЛогикаМатематикаМедицинаМеталлургияМеханикаОбразованиеОхрана трудаПедагогикаПолитикаПравоПсихологияРелигияРиторикаСоциологияСпортСтроительствоТехнологияТуризмФизикаФилософияФинансыХимияЧерчениеЭкологияЭкономикаЭлектроника






Микросателлиты






Микросателлиты - первые, полученные с использованием ПЦР, высокополиморфные маркеры для индивидуальных локусов. Подобно минисателлитам, микросателлиты относятся к диспергированным тандемно повторяющимся последовательностям, но единицы повторов (ди-, три- и тетрануклеотиды) и общий размер повторяющейся области существенно короче (как правило, не более 100 п.н.). Эти маркеры известны под несколькими названиями: микросателлиты, STMS (Sequence Tagged Microsattelite Site), STR (short tandem repeat), SSR (simple sequence repeat). По аналогии с системой STS была предложена система STMS, которая фактически является частью системы STS. Для создания STR подбираются праймеры к уникальным последовательностям ДНК, фланкирующим микросателлитный повтор, что требует предварительного знания их нуклеотидной последовательности. Полиморфизм STR определяется различной копийностью мономерных единиц в кластере, что приводит к существованию множественных аллельных вариантов. Гетерозиготность их очень высока (часто более 75%). При создании новых полиморфных маркеров, кроме динуклеотидов, используются микросателлиты три- и тетрамерных мотивов, значительная часть которых также высокогетерозиготна. Благодаря большей длине звена, применение тримеров и тетрамеров позволяет упростить методику анализа аллельного полиморфизма.

Микросателлиты широко распространены в эукариотических геномах (как растительных, так и животных). Например, в геноме человека динуклеотидные повторы встречаются в среднем каждые 2 т.п.н.

Согласно общепринятой точке зрения, полиморфизм микросателлитов обусловлен ошибками (эффект " проскальзывания") в процессе репликации или репарации ДНК. Средний темп мутирования динуклеотидных повторов оценивают примерно в 6, 9х10-4, хотя эти оценки могут существенно различаться.

Высокий уровень полиморфизма микросателлитов, относительно равномерное их распределение в эухроматиновой части геномов и широкая представленность сделали их чрезвычайно популярными. Применение их при картировании генома человека позволило совместить физические и генетические карты хромосом. Гипервариабельные микросателлиты представляют собой универсальную систему генетических маркеров для анализа наследуемых изменений на уровне ядерной ДНК и широко используются в исследованиях генетического полиморфизма популяций человека, растений и животных.

Несмотря на высокую популярность микросателлитов, они имеют и некоторые недостатки. Неравномерность скорости мутирования разных микросателлитов создает определенные сложности для популяционно-генетического анализа. Имеются и технические проблемы, такие как артефакты при проведении ПЦР (за счет эффекта " проскальзывания"), сложности в разработке технологий для автоматического скрининга микросателлитных аллелей. Кроме того, несмотря на высокую плотность микросателлитных локусов в геноме, их бывает недостаточно для тонкого картирования отдельных областей геномов, создания маркеров для локусов количественных признаков (QTL) и решения многих других задач.

Полиморфные маркеры, основанные на тестировании однонуклеотидных замен (SNPs)

Согласно общепринятому определению SNPs (от англ. Single Nucleotide Polymorphism) - это однонуклеотидные позиции в геномной ДНК, для которых в популяции имеются различные варианты последовательностей (аллели) с частотой редкого аллеля не менее 1%. В базы данных SNPs обычно включают все небольшие изменения геномных последовательностей (небольшие инсерции/делеции (так называемые " intels"), изменения нескольких нуклеотидов), хотя они и не входят в формальное определение SNPs. Обычно SNPs представлены двумя аллельными вариантами, хотя встречаются и трехаллельные SNPs (например, в геноме человека их около 0, 1% от всех SNPs).

SNPs не являются совершенно новым типом ДНК-маркеров. Самые первые ДНК-маркеры (ПДРФ-маркеры) также относятся к этому типу. Однако введение этого термина позволило объединить под общим названием все маркеры, обусловленные одиночными нуклеотидными заменами в последовательности ДНК, независимо от способа их тестирования.

SNPs чрезвычайно широко распространены не только в геноме человека, но и в геномах других организмов. Предполагается, что у человека точковые замены наблюдаются один раз на 1000 нуклеотидов. В настоящее время в базах данных по нуклеотидным последовательностям человека представлены около 6 млн. SNPs. Огромное количество SNPs в геноме человека позволяет отобрать порядка 100000 так называемых " распространенных" (с частотой редкого аллеля более 20%) SNP-маркеров, при среднем расстоянии между маркерами 30 т.п.н. Никакой другой тип геномных различий не способен обеспечить такую плотность маркеров. Помимо высокой плотности, SNPs имеют низкий уровень мутаций на поколение (~10-8), что делает их удобными маркерами молекулярной эволюции при оценке крупномасштабных эволюционных событий.

Основным достоинством SNPs является возможность использования автоматических методов их детекции, например, использование ДНК-микропанелей (microarrays). Существующие способы тестирования SNPs можно условно разделить на несколько групп,. Разделение условно, поскольку в большинстве случаев используются сочетания различных подходов. Подробно с методами типирования SNPs можно ознакомиться в обзоре, представленном на сайте Здесь мы рассмотрим лишь некоторые, наиболее распространенные методы.

ПЦР-ПДРФ. Этот метод относится к ферментативным методам анализа SNPs и аналогичен методу ПДРФ, но в его основе лежит использование ПЦР. Рестрикции (одной или несколькими рестриктазами) в этом случае подвергаются продукты амплификации, а не геномная ДНК. Благодаря простоте и надежности метод получил широкое распространение и до сих пор используется для анализа аллельного полиморфизма генов у самых разных объектов. Ограничением метода является то, что с его помощью можно тестировать только известные мутации, затрагивающие сайты рестрикции. В зарубежных публикациях широко используется термин CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) - рестрикционный полиморфизм амплифицированных последовательностей. CAPS-маркеры считаются вторичными маркерами, так как праймеры для них создаются после выявления SNP на основе анализа нуклеотидной последовательности.

Аллель-специфичная ПЦР. Аллельные варианты различаются за счет того, что 3'-концевой нуклеотид одного из праймеров гибридизуется непосредственно с вариабельным нуклеотидом (позиция SNP), что обуславливает наличие или отсутствие ПЦР. Специфичность реакции можно повысить, вводя дополнительный, не спаренный нуклеотид во второй или третьей позиции с 3'-конца этого же праймера или используя конкурирующую ПЦР в той же пробирке. Аллель-специфичная ПЦР широко используется для типирования отдельных аллелей генов, или групп аллелей, несущих одинаковые мотивы, например, для типирования аллелей, определяющих устойчивость или восприимчивость крупного рогатого скота к лейкозу.

ПЦР с терминацией синтеза. Существует несколько вариантов этого подхода. В одном из них ПЦР проводится по стандартной схеме, но один из дезоксинуклеозидтрифосфатов берется в лимитирующей реакцию концентрации. Это приводит к тому, что после нескольких циклов синтез ДНК обрывается в позициях, соответствующих лимитирующему нуклеотиду. Реакция напоминает секвенирование. Метод прост в исполнении, но для детекции SNP не очень удобен, т.к. требует подбора условий ПЦР для каждого локуса.

Однонитевой конформационный полиморфизм ДНК (SSCP, Single Strand Conformation Polymorphism) в особенности эффективен для поиска новых однонуклеотидных замен в ДНК. Метод SSCP заключается в следующем: после проведения PCR продукт амплификации денатурируют и полученные однонитевые молекулы разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Любая нуклеотидная замена в исследуемой последовательности приводит к изменению заряда однонитевого фрагмента, а следовательно, и его электрофоретической подвижности и может быть тестирована в качестве полиморфного варианта. Этот подход позволяет выявлять нуклеотидные замены, делеции, инсерции на протяжении всей длины амплифицированного продукта, а не только в местах узнавания рестриктаз, что делает этот подход более информативным. Простота метода, умеренная стоимость и возможность использования флуоресцентной метки и капиллярного электрофореза (ABI Prism 310) позволяет легко автоматизировать процесс и анализировать одновременно большое количество локусов.

Для типирования однонуклеотидных замен в ПЦР-продуктах могут быть использованы методы электрофореза в денатурирующих гелях с постоянной концентрацией денатурирующего агента (CGGE - constant gradient gel electrophoresis), с градиентом денатурирующего агента (денатурирующий градиентный гель-электрофорез, DGGE - denaturating gradient gel electrophoresis), или с использованием градиента температуры (TGGE - temperature gradient gel electrophoresis). Методы разделения основаны на различиях в температуре плавления фрагментов ДНК с разной нуклеотидной последовательностью. Содержащий мутацию фрагмент обнаруживается по изменённой электрофоретической подвижности. В качестве денатурирующих агентов используют чаще всего формамид или мочевину.

Анализ гетеродуплексов. В этом случае денатурированные контрольный и анализируемый ПЦР-продукты не разделяют в геле, а сначала позволяют им ренатурировать. Одноцепочечные фрагменты образуют гомодуплексы, если последовательности двух цепей полностью комплементарны, или гетеродуплексы, если они отличаются хотя бы на один нуклеотид. Гомо- и гетеродуплексы имеют разную электрофоретическую подвижность, что используется для их разделения.

Для тестирования гетеродуплексов могут быть использованы химические методы их расщепления, обеспечивающие практически 100%-ное узнавание всех типов гетеродуплексов, что недоступно при использовании современных ферментативных подходов. К недостаткам метода следует отнести сложность процедуры и токсичность используемых реагентов.

Детекция на твёрдых подложках (микропанелях, англ. microarrays). Микропанель - это твердый носитель небольшого размера (например, стекло, нейлон или металлическая пластинка) с прикрепленными к нему в определенном порядке короткими олигонуклеотидами или фрагментами ДНК. Прикрепление одного из компонентов реакции к подложке позволяет проводить параллельно множество реакций, пространственно разделив детекцию отдельных SNPs. Микропанели могут применяться как для скрининга мутаций, так и для детекции известных аллелей. О наличии/отсутствии мутации судят по уровню гибридизационного сигнала тестируемой ДНК с иммобилизованными на матрице фрагментами.

В случае поиска еще неизвестных SNP на матрице иммобилизуются олигонуклеотиды, содержащие в каждой позиции любой из четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов (VDA, variant detector array). Олигонуклеотид, полностью комплементарный флуресцентно-меченому зонду, даст более сильный сигнал, чем отличающиеся от него в одной из позиций. Скринирование уже известных SNPs значительно упрощается, так как в каждом случае нужны только те олигонуклеотиды, которые соответствуют известным аллельным вариантам. Такие аллель-специфичные наборы олигонуклеотидов были использованы для генотипирования SNPs в различных генах человека. Дальнейшее усовершенствование метода идет в сторону увеличения количества и плотности расположения олигонуклеотидов на носителе, а также повышения чувствительности и специфичности гибридизации.

Физические методы детекции SNP. Альтернативой существующим методам детекции полиморфных участков ДНК является масс-спектрометрическое дифференциальное секвенирование. Время, затрачиваемое на анализ каждого образца этим методом составляет всего несколько секунд. Метод очень чувствителен, позволяет дифференцировать гомо- и гетерозиготы и оценивать долю SNP при одновременном анализе нескольких образцов. Существуют и другие методы детекции SNPs, использующие современные технологии. Все они обладают большими достоинствами, но требуют специального дорогостоящего оборудования.

Секвенирование. Самый точный метод детекции SNP, несомненно, прямое секвенирование интересующего участка генома. Но это дорогой и трудоемкий метод при массовом анализе образцов. Предложено несколько модификаций реакции, снижающих её стоимость, например, секвенирование обеих цепей в одной реакции с использованием двух различно меченых праймеров, совмещение ПЦР и секвенирования в одной пробирке сразу для нескольких локусов и другие.






© 2023 :: MyLektsii.ru :: Мои Лекции
Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав.
Копирование текстов разрешено только с указанием индексируемой ссылки на источник.