Формирование сигнальных путей, подавляющих функциональную активность клеток

Рассмотренные выше механизмы формирования сигнальных путей в разных клетках, опосредованных через активацию различных Рц, свидетельствуют о том, что в эти процессы вовлекается множество молекул, обеспечивающих каскадное проведение сигнала. Совершенно очевидно, что блокирование любого этапа этого каскада вследствие генетических причин или внешних воздействий прерывает дальнейшее развитие сигнального пути и предотвращает активацию клетки. Такое заключение подтверждается различными примерами блокирования сигнализации и, как следствие, клеточной активации. Так например, в макрофагах мышей с дефицитом молекул семейства Src не происходит процесс фосфорилирования молекул ITAM, блокируется процесс формирования сигнального пути, фагоцитоз частиц, опсонизированных IgG, не происходит [568]. Как отмечалось выше, блокирование прохождения сигнала наблюдается также в случаях подавляющих воздействий на активность раличных ферментных систем клетки — семейства молекул гуанозинтрифофатаз Rho, протеинкиназы С (PKC), фосфолипазы С (PLC), фосфатидилинозитол–3–киназы (PI–3К) и др.

Блокирование формирования и прохождения активирующего сигнала внутрь клетки обеспечивается и другими механизмами — путём активации мембранных структур иного, не стимулирующего, характера. В процессе исследования особенностей действия различных молекул, оказывающих регуляторное действие на функции иммунокомпетентных клеток, было установлено, что наряду с Рц, обеспечивающими формирование сигнальных путей, приводящих к активации клеточных функций, на лимфоцитах различных популяций (Т, В, NK) экспрессируются также особые Рц, связывание которых с соответствующими лигандами сопровождается подавлением внутриклеточных процессов. Среди ингибиторных Рц T–лимфоцитов выявлен Рц CTLA4; B–лимфоцитов — CD5, CD22, CD66A, CD72, FcgRIIB, ILT, LAIR–1, PD1, PIR-B; EKK — CD94/NKG2, KIR, Ly49. Рц ILT (CD85, LIR, MIR) и LAIR–1 экспрессируются не только на B–лимфоцитах, но также на миелоидных клетках и на других гемопоэтических типах клеток [488]. Цитоплазматические цепи многих из этих Рц включают домены ITIM. В результате кластеризации Рц, обусловленных их взаимодействием с лигандами, молекулы ITIM фосфорилируются киназами семейства Src. При этом в доменах ITIM образуются участки, доступные для связывания домена SH2 тирозинфосфатазы SHP–1 и инозитолфосфатазы SHIP (от — SH2-containing inositol polyphosphate 5-phospatase), обеспечивающих дальнейшее прохождение ингибиторного сигнала внутрь клетки. Эти пути не перекрываются, а молекулы SHP–1 и SHIP связываются с доменами ITIM разных ингибирующих Рц, например PIR-B и FcgRIIB B–лимфоцитов, соответственно. Связывание домена SH2 тирозинфосфатазы SHP–1 с молекулой ITIM Рц PIR-B сопровождается существенным снижением процессов активации, индуцируемых антигенраспознающим Рц BCR. Прежде всего, это касается процесса дефосфорилирования ряда внутриклеточных субстратов, включающих непосредственно BCR, активируемых BCR тиро-зинкиназ (например, Syk), мишеней этих киназ (например, адаптерного белкаBLNK), а также PLC–g1. Поскольку молекула SHP–1 вовлекается в ингибиторный процесс прохождения сигнала на ранних стадиях клеточной активации, то действие этого фермента приводит к блокированию последующих каскадных этапов, включая мобилизацию кальция, секрецию цитокинов, активацию процесса транскрипции и пролиферации клеток. У мышей с дефицитом SHP–1 развиваются признаки тяжёлого комбинированного иммунодефицита и аутоиммунных поражений, в первую неделю жизни регистрируются лёгочные осложнения.

В отличие от тирозинфосфатазы SHP–1, инозитолфосфатаза SHIP связывается с фосфорилированной молекулой ITIM ингибиторного Fc–Рц для IgG — FcgRIIB. Процесс фосфорилирования осуществляет киназа Lyn, активируемая в результате коагрегации лигандом BCR и FcgRIIB. Такое связывание сопровождается гидролизом мембранного PIP₃ и блокадой вовлечения в активационный процесс киназ семейства Tec и фосфолипазы С. Это сопровождается уменьшением содержания в клетке фосфатидилинозиттрифосфата (РIР₃) и диацилглицерина (ДАГ) и блокадой притока внеклеточного кальция. Фосфорилирование ITIM ингибиторного Рц Fc RIIB приводит также к блокированию клеточной пролиферации в результате воздействия на активацию МАP–киназы и на вовлечение в процесс антиапоптотической протеинкиназы Akt.

Экспрессия Рц FcgRIIB широко распространена, регистрируется на всех лейкоцитах. Физиологическая значимость этого Рц может быть подтверждена многими примерами иммунологических нарушений, наблюдаемых при его недостаточности. Считается, что FcgRIIB обеспечивает поддержание периферической толерантности B–лимфоцитов, подверженных соматической гипермутации и является фактором генетической предрасположенности к аутоиммунным заболеваниям (при дефиците FcgRIIB у животных развиваются аутоиммунные заболевания — индуцированный коллагеном артрит, синдром Гудпасчеpa; при нокауте гена FcgRIIB аутоиммунные поражения выявляются у мышей на основе линии C57BL/6, но не линий 129 или BALB/c), страдает дифференцировка B–лимфоцитов, нарушается B–клеточный ответ на Аг, усиливается ответ на патогенные АТ класса IgG, регистрируются патологические изменения в проявлении пассивной реакции Артюса в коже и лёгких. Одним из механизмов, определяющих сниженную активность Рц является дефицит инозитолфосфатазы SHIP. Мыши с дефицитом SHIP характеризуются низкой активностью Рц FcgRIIB, гиперреактивностью, у них регистрируется повышенная пролиферативная активность миелоидных клеток, наблюдается сниженная апоптотическая активность [488].

Важным регулятором эффекторного ответа на IgG является отношение FcgRIII/FcgRIIB. Низкое соотношение, характерное для покоящихся эффекторных клеток, имеет следствием высокий порог клеточной активации иммунными комплексами, что предотвращает возможность проявления воспалительного ответа, несоответствующего интенсивности воздействия. При высоком соотношении Рц, наблюдаемом например у активированных макрофагов и тучных клеток, создаются благоприятные условия для развития воспалительного ответа.

В отличие от активации ингибиторных Рц PIR-B и FcgRIIB B–лимфоцитов, связывающих, соответственно SHP–1 и SHIP фосфорилированной молекулой ITIM, формирование ингибиторного сигнала при связывании лиганда с другим ингибиторным Рц B–лимфоцитов — CD22 опосредуется через связывание фосфорилированной молекулы ITIM как с тирозинфосфатазой SHP–1, так и с инозитолфосфатазой SHIP с вовлечением в сигнальный каскад молекул Chc и Grb2. Следует отметить однако, что несмотря на значимость фосфорилирования ITIM для формирования сигнального пути, по-видимому, существуют и другие механизмы индукции прохождения ингибирующего сигнала внутрь клетки. Так например, получены конструкции ингибиторного Рц CD5, не содержащего молекулы ITIM (обычно CD5 эту молекулу содержит), но сохраняющего ингибиторную активность. Более того, ингибиторный Рц T–лимфоцитов — CTLA4 не содержит цитоплазматического домена ITIM, хотя этот Рц и связывает тирозинфосфатазу SHP–2 [488]. Считают, что тирозинфосфатаза SHP–2, в отличие от SHP–1, играет позитивную регуляторную роль в формировании сигнального пути, обеспечиваемого активацией протеинтирозинкиназы [310].

Ингибиторные Рц NK идентифицированы как у мышей (Ly49), так и у человека (KIR), Рц CD94/NKG2 обнаружен на мембране NK человека и мышей. Эти Рц характеризуются специфичностью к полиморфным эпитопам молекул ГКГС класса I. Рц KIR (от Killer cell Ig–like Receptor) помимо NK экспрессируется на T–клетках памяти, кодируется примерно двенадцатью полиморфными генами, распознаёт полиморфные эпитопы лейкоцитарных Аг человека HLA–A, HLA–B и HLA–C. Примерно половина Рц KIR включает по два цитоплазматических домена ITIM, фосфорилированные молекулы которых преимущественно связывают тирозинфосфатазу SHP–1, обеспечивают формирование сигнального пути, результатом которого является подавление секреции цитокинов и опосредованной клетками цитотоксичности. Другая половина Рц KIR является его активирующей изоформой, которая не содержит цитоплазматических доменов ITIM, но связывается с адаптерным белком DAP12, содержащим молекулы ITAM. Одновременная экспрессия на NK активирующего и ингибирующего Рц, распознающих различные лиганды Аг HLA класса I, обеспечивает элиминацию клеток, которые утратили лиганды для ингибиторного Рц, но сохранили лиганды для активирующего Рц.

Не менее значимую физиологическую роль играет ингибиторный Рц NK — CD94/NKG2A. Этот Рц характеризуется как гетеродимер, соединенный дисульфидными связями, его СЕ кодируются генами CD94 и NKG2A. СЕ CD94 имеет короткий цитоплазматический домен, не несущий сигнальной функции. Другая СЕ — NKG2A содержит два домена ITIM, которые в результате фосфорилирования тирозина связывают тирозинфосфатазы SHP–1 или SHP–2. Рц экспрессируется примерно на половине NK и на субпопуляции T–клеток памяти фенотипа CD8, распознаёт Аг ГКГС человека класса I HLA–E и гомологичные мышиные молекулы Qa1^b. Необходимо отметить, что пептид–связывающий «желоб» (раздел главы 5 «Строение главного комплекса гистосовместимости») специфичностей HLA–E и Qa1^b включает 9 АК–последовательностей, тождественных таковым лидерных сегментов других молекул ГКСГ класса I — H–2D, Н–2К — у мышей, HLA–A, HLA–B, HLA–С, HLA–G — у человека. При отсутствии таких пептидов в «желобе», молекулы HLA–E и Qa1^b удерживаются в цитоплазме клетки-хозяина и деградируют. Такой механизм позволяет NK и T–лимфоцитам, несущим Рц CD94/NKG2А, глобально проводить мониторинг экспрессии в тканях Аг ГКГС класса I. Рц CD94/NKG2C, как и Рц CD94/NKG2A, также распознаёт специфичности HLA–E и Qa1^b, однако он не содержит цитоплазматических доменов ITIM и связывает адаптерный белок DAP12 в виде части активирующего рецепторного комплекса [488].

В целом, накопленный к настоящему времени материал по анализу механизмов, обеспечивающих активацию функциональной активности иммунокомпетентных клеток или, наоборот, её подавление показывает, что конечный результат зависит, по меньшей мере, от двух факторов — генетически детерминированных особенностей формирования сигнального пути в конкретной популяции клеток (от строения клеточных Рц, взаимодействующих с соответствующими лигандами, и последовательного включения в процесс различных цитоплазматических молекул до продукции специфических медиаторов, через которые опосредуется функциональная активность данной клеточной популяции) и возможности его блокирования в результате различного рода воздействий на развивающийся процесс. Иначе говоря, экспрессия на иммунокомпетентных клетках активирующих и ингибиторных Рц и их функционирование определяет физиологический процесс активации иммунокомпетентных клеток или наоборот, торможения их функций. При врождённой недостаточности отдельных компонентов сигнальных путей не только извращается нормальная последовательность реакций сигнального каскада, но и формируются патологические состояния с клиническим проявлением тяжелейших иммунозависимых заболеваний. Совершенно очевидно, что дальнейшее изучение молекулярных механизмов прохождения активирующего и ингибиторного сигналов внутрь клетки даст новые практически значимые и существенно более тонкие инструменты диагностики иммунозависимых патологических состояний, их прогнозирования и терапии. Отдельные, вышеприведенные примеры воздействия, в том числе ЛС, на молекулярные превращения каскадного сигнала наглядно демонстрируют такую возможность.