Сургут, 2002 г.

Министерство образования российской федерации

Сургутский государственный университет

В. М. Еськов, В. А. Папшев

БИОФИЗИКА

Учебное пособие для студентов биологических факультетов университетов по выполнению лабораторно-практических работ

(часть 2)

Сургут, 2002 г.

Лабораторная работа № 2.1

ЭЛЕКТРОЁМКОСТЬ БИОМЕМБРАН.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭЛЕКТРОЁМКОСТИ КОНДЕНСАТОРОВ.

Цель работы.

Обучающийся должен знать:

1) основные законы электростатики, понятия напряженности (Е) электрического поля (ЭП), потенциала (U), связь между E и U, понятие электроёмкости (С) тел и электроёмкость мембран;

2) определение С для сферы и плоских конденсаторов, основные законы последовательного и параллельного соединения конденсаторов;

3) строение и электрические свойства мембран, способы получения искусственных биомембран, механизм функционирования электрических органов рыб.

Обучающий должен уметь:

1) экспериментально определять электроёмкости различных тел;

2) проверять законы последовательного и параллельного соединения конденсаторов;

3) определять ёмкостные свойства биотканей.

Практическое значение

Рассматриваемые явления лежат в основе жизнедеятельности всех клеточных организмов, т.к. все биомембраны имеют барьерные функции и, следовательно, обладают ёмкостными свойствами. Отметим, что ёмкостными свойствами обладают и тканевые мембраны (кожа, гематоэнцефалический барьер и т.д.). Изменение ёмкостных свойств клеточных и тканевых мембран- причина многих патологических состояний и болезней человека, животных, растений. Знание законов последовательного и параллельного соединения ёмкостных элементов дает возможность понимать морфофункциональные свойства клетки и многоклеточных организмов, их поведение в естественных и искусственных электрических полях (физиотерапия!)– ЭП.

Бюджет времени

На изучение темы отводится 9 часов. Из них 4 часа- лекции, 2 часа- лабораторные занятия и 3 часа- на самоподготовку.

Литература

1. Ревин В.В., Максимов Г.В., Кольс О.Р. Физиология и биофизика мембранных процессов.- Саранск: Изд-во Мордов. ун-та, 1995.- 96с.

2. Владимиров Ю.А., Рощупкин Д.И., Потапенко А.Я., Деев А.И. Биофизика. - М.: Медицина, 1983.- 272с.

3. Болдырев А.А., Котелевцев С.В., Ланис М. и др. Введение в биомембранологию.- М.: Изд-во Моск. ун-та, 1990.- 208с.

4. Албертс В., Брей Д., Льюис Дж. и др Молекулярная биология клетки.- М.: Мир, 1986.

5. Рубин А.В. Биофизика: В 2 кн.- М.: Высш. шк., 1987.- Кн.1

6. Бергельсон Л.Д. Биологические мембраны.- М.: Наука, 1975.- 184с.

Методические указания по 1- му этапу

" Самоподготовка"

Цель этапа: 1) Повторить исходную информацию из школьного курса;

2) Изучить и проверить свои знания по новой информации из лекционного курса.

Проверка уровня знаний

Для изучения темы необходимо возобновить старые знания, связанные с понятиями электростатики и выучить новый материал, используя конспект лекций и вспомогательную литературу.

Для самоконтроля необходимо ответить на вопросы и решить следующие задачи:

1. Причины возникновения ЭП. Явление трибоэлектричества. Силовые линии ЭП.

2. Напряженность Е ЭП. Единицы измерения. От чего зависит Е для точечного заряда?

3. Влияние среды на Е. Что такое поляризация среды? Охарактеризуйте основные виды поляризации.

4. Понятие потенциала для ЭП. Потенциал точечного заряда (вывод).

5. Какова связь между U и E? Понятие однородного поля.

6. Что такое электроёмкость ЭП? Вывод формул С для сферы и для плоского конденсатора.

7. Вывод законов последовательного и параллельного соединения конденсаторов.

8. Понятие электроёмкости биомембраны. От чего она зависит?

9. Почему у биомембран большие электроёмкости? Объясните!

10. Разность потенциалов между наружной и внутренней средой клетки 40мВ. Каков заряд на мембране, если её площадь S=0, 001 мм², толщина d=10^-8 мм, а диэлектрическая проницаемость e=10⁴? Определить плотность зарядов на мембране G для данного случая.

11. Какова электроёмкость мембраны, если на частоте 50 Гц её сопротивление составляет R=1000 Ом?

Методические указания по 2-му этапу

" Выполнение работы"

Цель этапа: 1. Практически изучить методы определения электроёмкости конденсаторов и биомембран.

2. Проверить законы последовательного и параллельного соединения конденсаторов.

Для достижения цели необходимо выполнить следующие действия:

1. Ознакомиться с работой эксперимен­тальной установки по определению ёмкостных свойств биотканей, которая включает в себя 2-е модели тканевых мембран с различными (С₁ и С₂) ёмкостными свойствами, источник постоянного напряжения и переключатель П, нагрузочное сопротивление R прибор для регистрации силы тока (милиамперметр Рис. 1

mA). Принципиальная схема устройства для измерения электроёмкости представлена на рис.1.

2. С помощью проводников подключите к установке первую модель биоткани (С₁), поставив переключатель П в левое положение, что соответствует зарядке С₁ до потенциала U. Затем резко переключите П в правое положение и регистрируйте ток каждые 5 секунд по показаниям mA. Постойте график зависимости I=I(t) и для двух различных t₁ и t₂ определите по графику значения I₁ и I₂ (аккуратно выполняйте интерполяцию при построении). Из формулы

C₁=(t₂-t₁)/(R× ln(I₁/I₂))

определите значение С₁ не менее 4-х раз, рассчитайте доверительный интервал для С₁.

3. Аналогичные действия произведите для С₂, а затем для параллельного и последовательного соединения С₁ и С₂. Обратите внимание на начальные (стартовые) значения токов для разных С₁ и С₂! Где ток I больше? Если С₁> С₂, то I₁> I₂ или наоборот? Объясните почему. Если С₁ и С₂ соединяются параллельно, то I₃> I₁ и I₂. Какое отношение это имеет к электрическим органам рыб? Проверьте по средним значениям, что при параллельном соединении С_общ=С₁+С₂, а при последовательном 1/С_общ=1/C₁+1/C₂ с учетом погрешности измерений. Сделайте вывод о правильности законов последовательного и параллельного соединения конденсаторов, моделирующих свойства биомембран.

Блок информации

Существование всего живого началось с обособления внутренней среды от внешней с помощью специальных структур- биомембран (БМ) (membrana- перепонка, кожица, оболочка). Существуют клеточные (плазматические) мембраны, мембраны ограничивающие органоиды (мембраны хлоропластов, митохондрий, лизосом, эндоплазматического ретикулума и т.д.). Мембраны отличаются плотной упаковкой составных компонент (белков, липидов, углеводов, макромолекул (гликолипиды, гликопротеиды), минорных компонент (нуклеиновые кислоты, коферменты, антиоксиданты, ионы Na⁺, K⁺, Ca²⁺ и др.) и составляют более 50% веса сухого вещества клеток. 110 лет назад (1890 г.) В.Пфеффер предложил название клеточной мембраны, однако только в 40-х годах 20-го века мы начали исследовать ультратонкую (размеры не более 10 нм) структуру БМ на электронных микроскопах. В настоящее время существуют различные методы исследования БМ (последовательно):

1. Путем разрушения (осмотическим шоком- эритроциты; гомогенизатором- печень, мозг; растирание с кварцевым песком- мышцы) и последующим центрифугированием. При этом: 600g- осаждаются митохондрии, 20000-100000g- микросомы (смесь везикул размером 0, 3-3 мкм). Иногда эту операцию делают в градиенте сахарозы.

2. Рентгеноструктурный анализ БМ по изучению дифракционных картин.

3. Ядерный магнитный резонанс (ЯМР). При этом часто используют изотопы С¹³, Н¹, Р³¹. В методе оценивается мера " подвижности" отдельных атомов и молекул. Например, используя Р³¹ изучают поведение фосфолипидов в модельных и природных мембранах.

4. Электронный парамагнитный резонанс (ЭПР) для изучения свободных радикалов и ионов, триплетных состояний в фотобиологических реакциях.

5. Электронная микроскопия.

6. Флуоресцентная микроскопия (зонды- красители, например, связывающиеся с БМ).

7. Инфракрасная спектроскопия (ИКС) и комбинационного рассеяния (КРС) для получения информации о конформации молекул.

8. Моделирование (физическое, математическое и т.д.) липидных БМ. При этом гидрофобной (неполярной)- в гептановом растворе фосфолипида, а гидрофильной- в водном белковом растворе. По химическому составу БМ весьма разнообразны. Они содержат фосфолипиды, белки, углеводы, минорные комплексы (нуклеиновые кислоты, полиамины, Н₂О, ионы. Причем белки- 60-65%, фосфолипиды- 35-40%. Фосфолипиды в мембранах бывают 3-х классов: фосфолипиды, гликолипиды и стероиды. Производные фосфорной кислоты (фосфолипиды и глицерофосфолипиды) основные в процентном отношении. Молекула фосфатидилхолина (ФДХ) содержит следующие фрагменты:

Часто встречаются: ФДХ, фосфатидилэтаноламин (ФЭА), фосфатидилсерин (ФС), фосфатидилинозит (ФИ), сфинголипиты, сфингомиелин; в хлоропластах- моно- и дигалактодиглицериды. Белки в БМ- гидрофобные глобулярные структуры, связанные с мембранами (например, гликофорин в эритроцитах). Часто эти белки обладают ферментными свойствами, антигенными (ответственны за иммунную реакцию) и рецепторными (холинорецептор).

Разделение зарядов в пространстве и возникновение вследствие этого электрических полей наблюдается на всех уровнях организации живой природы. В простейшем случае это имеет место уже на уровне отдельных молекул, обладающих жестким дипольным моментом (вода, аминокислоты, фосфолипиды и т.д.). Объединение таких молекул в агрегаты (например, фосфолипидов) приводит к возникновению плоских или пространственных биоструктур, которые выполняют различные функции в организмах животных и растений. Например, полярные мембраны выполняют барьерные функции, а полярный актин-миозиновый комплекс обеспечивает движение организма или его частей. Любая мембрана, отделяя внешнюю среду от внутренней, обязательно обеспечивает и разделение зарядов (ионов), что неизбежно приводит к возникновению ёмкостных свойств таких структур. Что же такое электроёмкость и как она определяется экспериментально? На этот вопрос и дается ответ в данной работе.

Для понимания сущности предлагаемых методов необходимо напомнить основные понятия из электростатики. Известно, что электрическое поле (ЭП)- особый вид материи. Его силовой характеристикой является вектор напряженности ЭП- , который численно равен силе F, действующей на единичный положительный пробный заряд q, внесенный в данную точку поля, а по направлению совпадает с вектором силы F, т.е. (Е измеряется в Н/Кл). Далее, энергетической характеристикой ЭП является потенциал j, который равен работе (или энергии) по перемещению единичного положительного заряда из бесконечности в данную точку ЭП, т.е. j=A/q (или j=W/q), где j измеряется в вольтах (В=Дж/Кл). На практике чаще используют Dj=U, где U- напряжение. Величины U и Е связаны уравнением , где вектор- градиент потенциала направлен в сторону увеличения потенциала. Градиент чаще обозначают буквой " набла" (Ñ), т.е.

.

В представленной записи Ñ - оператор, т.е. некоторое действие, которое надо совершить со скалярной величиной, что бы получить вектор. Вообще градиент это очень широкое понятие, которое используется в изучении процессов живой природы. Можно утверждать, что жизнь это наличие устойчивых градиентов (концентрации, температуры, давления и т.д.). Градиент потенциала на мембранах клеток обуславливает жизнедеятельность растительных и животных организмов.

Любое сферическое тело (растительная или животная клетка) радиусом r имеет свой потенциал

j=q/ee₀R

где R- расстояние от поверхности клетки до данной точки пространства. Распределенными зарядами в пространстве обладают и большие организмы. Например, человек имеет различные заряды ладоней и головы (это статическая картина). Кроме того, в организме постоянно генерируются ЭП (например, из-за работы сердца, мозга) и эти потенциалы также можно зарегистрировать. Таким образом, электрические поля играют большую роль в деятельности не только отдельных клеток (их мембран), но и в деятельности целостного организма. Взаимодействием слабых ЭП организмов (людей) можно объяснить различные экстрасенсорные явления. При этом надо учитывать, что у человека (у животных) существует огромное количество датчиков (рецепторных клеток), синхронизация работы которых может привести к гиперчувствительности, т.е. восприятию слабых сигналов на фоне сильных шумов. В этой связи уместно напомнить 2-ю теорему Шеннона, которая гласит, что с увеличением числа сенсоров возможен приём сигналов значительно меньших по уровню существующих шумов. Таким образом потенциально любой человек может воспринимать сверхслабые ЭП (другого человека) на уровне значительно меньшем уровня шумов. Это одно из объяснений феномена электромагнитной теории запахов, когда насекомое воспринимает запах самки (феромонов) при концентрации последних несколько молекул в 1 м³ воздуха.

Третьей базовой величиной в электростатике является электроёмкость- физическая величина численно равная заряду, который надо сообщить телу для увеличения его потенциала на 1 Вольт, т.е. C=q/U. Измеряется С в фарадах (Ф=Кл/В). Для сферического тела его электроёмкость равна

С=4pee₀r

где r- радиус тела. Сферическое тело в вакууме (e=1) при ёмкости 1Ф должно было бы иметь радиус r=C/4pee₀=1/4× 3, 14× 8, 85× 10^-12м»9× 10⁹м, что значительно больше радиуса Земли и соизмеримо с размерами Солнца. Существуют среды, у которых диэлектрическая проницаемость очень велика (у сегнетоэлектриков, в биосредах e~10⁴-10⁵) и тогда можно получать большие С при сравнительно небольших размерах. Это имеет место в электролитических конденсаторах или биомембранах. Поэтому электроёмкость биомембран может быть значительной. В технике и живой природе мы имеем дело с системой типа конденсатор, когда два заряженных тела (пространства) разделены диэлектриком. Для плоского конденсатора

C=ee₀S/4pd

где S- площадь пластин, d- толщина диэлектрика между пластинами. Заряженный конденсатор обладает энергией

W=CU²/2=q²/2C (измеряется в джоулях (Дж))

Любая мембрана клетки это конденсатор с указанной энергией и напряженностью ЭП на мембране E=U/d, где U разность потенциалов между внешней и внутренней средой (в среднем 10-60 мВ для животных клеток и до 100 мВ для растительных).

В растительном и животном мире мы часто имеем дело с многоклеточными организмами, когда клетки (и их мембраны) располагаются последовательно (друг за другом) или параллельно. В этом случае мы имеем дело с последовательным или параллельным соединением биоконденсаторов. Что при этом происходит с электроёмкостью? Можно показать, что при параллельно соединении С заряды на обкладках конденсаторов складываются (q_об=Sq_i), но q=CU, значит q_об=q₁+q₂ или C_обU_об=C₁U₁+C₂U₂. Поскольку при параллельном соединении U_об=U₁=U₂, то имеем С_об=С₁+С₂. При последовательном соединении напряжения складываются, т.е. U_об=U₁+U₂ или . Тогда , т.к. при последовательном соединении q_об=q₁=q₂.

Последовательное соединение и эффект увеличения напряжения мы имеем в электрических органах отдельных рыб (электрический скат, сом, угорь), когда U может достигать 800-1000 В. Такое напряжение способно при разрядке создать ток, который парализует жертву.

Таким образом, определяя С₁ и С₂ можно рассчитать С_об, что и предлагается выполнить экспериментально в данной работе. Для этого необходимо собрать цепь, состоящую из источника напряжения U, конденсатора C, нагрузочного сопротивления R и милиамперметра mA (см. рис.1). Если с помощью переключателя П сначала подсоединить С к источнику U и зарядить обкладки конденсатора до напряжения U, а затем переключить на правую половину цепи, в правой цепи при разрядке конденсатора С пойдет убывающий ток I=I(t), график изменения которого представлен на рис.2. Легко видеть, что при разрядке С убывает экспоненциально. Рассчитать этот закон легко с использованием закона Ома для правой цепи. Сумма падений напряжений (U_C+U_R) должна равняться ЭДС (Е=0), т.е. U_C+U_R=0 или IR=q/C. Но I=dq/dt и тогда получаем дифференциальное уравнение с разделяющимися переменными, т.е.

После его интегрирования получим, что

ln q- ln q₀= -t/RC

где q₀- произвольная константа.

После потенцирования имеем

q=q₀exp(-t/RC)

где q₀ имеет смысл первоначального рис. 2

заряда на пластинах С. Если взять два произвольных времени t₁ и t₂ и учесть, что мгновенный ток

,

то для t₁ и t₂ можно получить из графика соответствующие значения I₁ и I₂. Тогда I₁=I₀exp(-t₁/RC) и I₂=I₀exp(-t₂/RC)

Разделив 1-е уравнение на 2-е получим

I₁/I₂=exp[(t₁-t₂)/RC]

После логарифмирования имеем

ln (I₁/I₂)=(t₁-t₂)/RC или C=(t₁-t₂)/(R× ln (I₁/I₂))

Таким образом зная I₁ и I₂ из показаний mA для фиксированных t₁ и t₂ и величину R (спросить у преподавателя!) можно по графику рассчитать значение электроёмкости С. В нашей установке модели биомембран взяты нарочно с большими значениями С, что бы процесс изменения I(t) длился секундами и Вы могли бы фиксировать I через каждые 5 секунд визуально. При малых С вместо mA используются осциллографы с запоминанием и фиксированной скоростью развертки, тогда t реальное находится по экрану с учетом временного масштаба. Такие методы используются также в полярографии, когда находится концентрация кислорода, например в крови по кривой падения тока на электроде при коротком замыкании цепи. Скорость этого процесса зависит от окислительно- восстановительных реакций, например на медном электроде, что в свою очередь определяется парциальным давлением кислорода в крови при прочих равных условиях. В конечном итоге в таком полярографическом методе мы также имеем дело с явлением поляризации, образованием двойного электрического слоя (Д.Э.С.) и, значит, с системой подобной обыкновенному конденсатору.

Таким образом изучаемые в данной работе биофизические процессы являются базовыми для многих процессов в природе и их изучение крайне необходимо для познания законов живой природы.

Методические указания по 3-му этапу:

“Получение зачета по лабораторной работе”

После выполнения 1 и 2 этапов обучаемый должен заполнить протокол и подписать его у преподавателя, а затем оформить зачет в тетради, обратив особое внимание на количественное и качественное объяснение наблюдаемых изменений величин (целесообразно использовать ЭВМ для первичной статистической обработки) и отчитаться у преподавателя за всю работу. В этом случае обучаемый получает зачет.

Лабораторная работа № 2.2

БИОЭЛЕКТРИЧЕСКИЕ ЯВЛЕНИЯ В ЖИВОМ ОРГАНИЗМЕ.

РЕГИСТРАЦИЯ БИОПОТЕНЦИАЛОВ (БП).

ПОТЕНЦИАЛЫ ПОКОЯ (ПП)

Цель работы

Обучаемый должен знать: 1) биофизические аспекты электрогенеза; 2) основы классификации биоэлектрических явлений; 3) методы их регистрации.

Обучаемый должен уметь:

1) работать с электронным оборудованием для регистрации БП;

2) классифицировать БП при предъявлении фотоснимков различных процессов.

Практическое значение

Рассматриваемые процессы лежат в основе жизнедеятельности как животных организмов так и растительных объектов. Знание их имеет фундаментальное значение для понимания всего живого, а также целый ряд прикладных аспектов (диагностика, лечение, стимуляция жизнедеятельности, управление в биологических системах).

Бюджет времени.

На изучение темы отводится 6 часов: из них 2 часа лекций, 2 часа лабораторных занятий и 2 часа на самоподготовку.

ЛИТЕРАТУРА

1. Костюк П.Г., Гродзинский Д.М., Зима В.Л. и др. Биофизика. – Киев: Выща шк., 1988.- 504с.

2. Ходжкин А. Нервный импульс.- М.: Мир, 1965.- 126с.

3. Шеперд Г. Нейробиология.- М.: Мир, 1987.- Т.1, 456с.

5. Еськов В.М., Филатова О.Е. Статистическая обработка результатов измерений по естествознанию и экологии (СОРИПЕЭ). Сургут, 1998.

6. Максимов Г.В., Орлов С.Н. Транспорт ионов кальция при функционировании нервного волокна: механизмы и регуляция.- М.: Изд-во Моск. ун-та, 1994.- 88с.

Методические указания по 1-му этапу:

“Самоподготовка”.

Цель этапа: 1. Повторить исходную информацию, необходимую для изучения данной работы.

2. Изучить информацию, необходимую для выполнения 2 этапа.

I. Исходный уровень знаний.

Для изучений темы необходимо повторить:

1) понятие диффузии, осмоса и их роль в процессах жизнедеятельности организмов;

2) основные законы электростатики и физические величины из этого раздела;

3) понятие электрического тока, явления электролитической диссоциации, электрический ток в электролитах, понятие двойного электрического слоя.

Для самоконтроля решить следующие задачи и ответить на вопросы:

1. Что такое диффузия?

2. Каковы необходимые условия диффузии?

3. Запишите уравнение стационарной диффузии.

4. Что такое осмос?

5. Что такое напряженность ЭП и потенциал, как они связаны между собой?

6. Что такое электроемкость?

7. Что такое электрический ток?

8. Как образуется двойной электрический слой на электродах в электролите?

9. Чему равен электрохимический эквивалент металла, если при прохождении электрического тока I=1А через электролит за 1 час выделилось m=10мг вещества на электроде?

При разборе нового материала особое внимание следует обратить на принципы возникновения потенциала покоя (ПП) и потенциала действия (ПД), обусловленные различной диффузией ионов, специфическими свойствами мембран и различной растворимостью катионов и анионов в двух несмешивающихся фазах. Следует четко представлять классификацию биоэлектрических процессов, а также простейшие математические модели электрогенеза. При изучении суммарных БП, регистрируемых, например, с мышц конечностей, следует напомнить принцип суперпозиции ЭП, обратив особое внимание на синхронизацию регистрируемых БП.

Для контроля следует ответить на вопросы:

1. Что такое диффузный, мембранный и фазовый потенциалы? Каково их происхождение?

2. Запишите основные уравнения, описывающие ПП.

3. По каким физическим параметрам классифицируются БП и какие требования предъявляются к усилителям биопотенциалов (УБП) в этой связи?

4. Какой вид имеет дифференциальное уравнение, описывающие простейшие представления Берштейна?

5. Что такое интерференционная миограмма? Каковы особенности ее возникновения?

Методические указания по 2-му этапу:

“Выполнение работы”.

Цель этапа: зарегистрировать биопотенциалы покоя (БП) растительных клеток.

Для достижения цели необходимо:

1. Собрать электрическую цепь (см. рис.1) состоящую из растительного объекта 1 (половинка яблока), который помещается в ванночку 2 с проводящей средой 3 и неполяризующимся (хлорсеребрянным) электродом (ХЭ) 4. Второй ХЭ необходимо воткнуть в разрезанную часть яблока и оба электрода подключить УБП 5. Измеряйте потенциал через 5 мин. до постоянного значения, определите знак внутренней части яблока относительно внешней. рис.1

Измерьте потенциал 4 раза, проведите статистическую обработку результата. Срежьте слой кожуры с основания яблока, поместите его снова в измерительную ванночку. Проследите изменения потенциала через 5 мин. до постоянного значения. Объясните наблюдаемые изменения.

Блок информации.

Пассивный и активный транспорт веществ в клетках.

Биологические потенциалы. Их классификация

и причины возникновения.

Обеспечение различных процессов жизнедеятельности животного организма происходит за счет переноса молекул и ионов в пространстве. Во многих случаях этот перенос сопровождается различными биоэлектрическими процессами и (довольно часто) благодаря этим процессам, поэтому понимать сущность таких процессов на молекулярном уровне это значит понимать сущность механизмов функционирования животного организма. Следует отметить, что во многом подобные, такие процессы происходят и в растительных объектах, тем самым природа еще раз подчеркивает сущность всего живого на Земле, их диалектическую взаимосвязанность (единство и борьба противоположностей)

Особенностью живого, сложного организма является его клеточное строение, которое обеспечивает стабильность физико-химического состава внутренней среды и тем самым самостоятельное функционирование организма в природе.

При отсутствии такой стабильности организм легко погибает, что в эволюционном плане весьма нежелательно. Известно, что гомеостаз во многом обязан особым свойствам биологических (клеточных и тканевых) мембран. С некоторыми физическими особенностями таких процессов протекающих на микроуровне при прохождении электрического тока (поляризационные эффекты) через биологические мембраны Вы познакомились при изучении электропроводности биоструктур. Сегодняшняя наша задача биофизическая- рассмотрение процессов на микроуровне, т.е. что происходит при протекании электрического тока в биологических объектах и как он сам может возникнуть в этих объектах, условия его возникновения и возникновения потенциала и напряженности электрического поля (ЭП)-Е.

Напомним, что довольно часто перенос как заряженных так и не заря­женных частиц, подчиняющийся классическим физическим законам, так называемый пассивный транспорт, осуществляется за счет диффузии, ос­моса, фильтрации, аномального осмоса. Для пассивного транспорта харак­терно наличие некоторых градиентов (потенциала, концентрации, давле­ния), энергия которых и обеспечивает направленный ток заряженных или незаряженных частиц. Однако, существует и активный транспорт, который осуществляется за счет энергии метаболических процессов клеток (напри­мер энергия гидролиза аденозинтрифосфорной кислоты- АТФ) и он проис­ходит против указанных градиентов. Интимные механизмы активного транспорта еще полностью не раскрыты, но многое уже известно.

Пассивный транспорт подчиняется уравнению диффузии, которое с учетом градиента концентрации (Ñ С k-го вида молекул (или ионов) и градиента Ñ j потенциала электрического поля (Ñ j численно равно напряженности ЭП-Е) имеет общий вид:

(1)

где вектор тока частиц

₍2),

Отметим. что

(3),

Здесь U_k –подвижность, Z_k- заряд k-го иона, e- диэлектрическая проницаемость биосреды, D_k-коэффициент диффузии k-го типа ионов.

Как известно из молекулярной физики уравнение (1) утверждает, что изменение концентрации частиц k-го вида в замкнутом объеме V может быть обусловлено тем, что слева в объем V входит больше частиц, чем справа их выходит (см. рис.1)

Рис.2 Прохождение линий тока j через некоторый замкнутый

объём V (j₁- входящий вектор тока, j₂- выходящий).

Прохождение линий тока J через некоторый замкнутый объем V может протекать так, что ½ j₁½ > ½ j₂½ и ½ j₁½ -½ j₂½ > 0 (J₁-входящий вектор тока, J₂-выходящий) тогда частицы накапливаются внутри V, а если j₁=j₂, то и изменение С_к во времени не происходит . Уравнение (2) имеет простой физический смысл- вектор тока возникает только при наличии градиента концентрации частиц ( С_к), зависит от их свойств (коэффициент диффузии D) и, если частицы заряжены (заряд Z_k) и, обладают подвижностью (U_k) в электрическом поле ЭП Е=- , то под действием последнего они могут двигаться по градиенту потенциала. Поэтому второе слагаемое в уравнении (2) учитывает действие ЭП на заряженные частицы. Совокупность концентрационного и электрического градиентов называется электрохимическим градиентом, он обеспечивает многие процессы переноса в живой природе. Частный случай уравнения (1)- уравнение Фика для скорости диффузии вещества массой m

. (4)

Если частицы вступают в химические реакции, то в правой части уравнения (1) появляется функция источника f(C), т.е.

(5)

Отметим, что оператор для скалярной величины имеет вид

где -единичные векторы- орты. Уравнение (5) описывает наиболее общий процесс переноса веществ под действием. совокупности концентрационного и электрического градиентов, т.е. электрохимического градиента. Это обеспечивает многие процессы жизнедеятельности как отдельной клетки, так и целостного организма. В последнем случае мы можем иметь дело с тканевыми мембранами.

В экспериментах по изучению диффузии было обнаружено, что скорость проникновения в клетку аминокислот, глицерина, глюкозы не зависит линейно от , а получается намного больше. Чем это объяснить? Оказывается, что простое проникновение этих веществ через мембрану весьма затруднено, т.к. D мало, однако в мембране имеются молекулы переносчики, которые связываются с молекулами диффундирующего вещества В_к и образуют комплекс В_кZ, который обладает другим коэффициентом диффузии D_BZ. Внутри клетки B_k распадается B_kZ®B_k+Z и процесс повторяется до устранения (рис.2а). Число молекул Z ограничено, поэтому D_BZ зависит от С_к и нелинейно. Такого типа процессы называются облегченной диффузией. В некоторых случаях существует несколько видов Z_i (Z₁, Z₂, Z₃) встроенных в поры мембраны и происходит образование комплексов B_kZ_i по цепочке (см.рис.2) Отметим, что возможна конкуренция за связь между частицами разного вида В_к с переносчиком Z. Так например, поступление глюкозы в мышечные волокна уменьшаются при внесении в среду маннозы, ксилозы, арабиозы. Диффузия веществ через биологические мембраны (БМ) может избирательно усиливаться под действием ряда веществ. Например, антибиотик валиномицин, образуя комплекс с ионами К⁺ резко повышает проницаемость БМ. Диффузия может и наоборот- угнетаться. Например, белок тетродоксин блокирует диффузию Na⁺, токсины ботулизма резко влияют на механизм активного транспорта нейронов. Кроме диффузии в живых клетках большое значение имеет осмос- движение молекул воды через полупроницаемую мембрану из области меньшей концентрации некоторого вещества С_к в область большей концентрации. При этом создается осмотическое давление, которое по уравнению Вант-Гоффа зависит от концентрации в-ва С, температуры Т и изотонического коэффициента i, показывающего во сколько раз увеличивается количество растворенных частиц при диссоциации молекул (для неэлектролитов i=1). Фактически осмос- это диффузия молекул растворителя и для него выполняются все выше указанные законы. В частности, модификация уравнения Фика дает нам скорость осмотического переноса воды через мембрану

где Р=nkT (6)

Рис.3.Схема облегченной диффузии через мембрану клетки:

а- с одним переносчиком, б- с несколькими переносчиками встроенными в мембрану

Проникновение воды в клетку может происходить до момента уравновешивания осмотического давления гидростатическим. Однако возможен и разрыв клетки (гемолиз эритроцитов).

Перенос воды может осуществляться и путем фильтрации, благодаря наличию гидростатического давления. При этом скорость фильтрации находим из уравнения Пуазейля

(7)

Здесь r-радиус поры, через которую происходит фильтрация, h- коэффициент вязкости жидкости, l-длина поры, P₁-P₂ –перепад давлений на ее концах. Этому уравнению подчиняется процесс образования первичной мочи в почечных нефронах животных при фильтрации плазмы крови под действием кровяного давления которое, как известно, создается работой сердца. Особое значение для организма животного имеет осмотическое давление, создаваемое перепадом концентрации белков крови, так называемое онкотическое давление. Оно обеспечивает движение воды из лимфы в кровь. Различные отклонения в проницаемости клеточных и тканевых мембран, осмотического давления, кровяного давления приводят к серьезной патологии животного организма и может закончиться его гибелью.

Особое значение для жизнедеятельности животного организма имеет активный транспорт- перенос молекул и ионов против электрохимического градиента, осуществляемый клеткой за счет энергии метаболических процессов. При этом совершается определенная работа, которая может быть найдена из уравнения

A= nRTЧln , (8)

где n-число молей в-ва перенесенного через мембрану из области с концентрацией С₂ в область с концентрацией С₁. Так как в большинстве случаев мембрана заряжена до разности потенциалов j₁-j₂, то для переноса заряженных частиц через мембрану совершается некоторая дополнительная работа, и суммарная работа будет равна:

A=nRTln ± FnZ( , (9)

где F-число Фарадея (F=96500 кл).

Исследованиями биофизиков доказано наличие специальных переносчиков, которые находятся вблизи мембраны или встроены в нее. Причем, выделяют переносчики заряженных частиц (ионов) и различных нейтральных молекул (сахара, аминокислоты). Многочисленные исследования по методу фиксации потенциала на мембране (Уссинг, Наточин), с изотопами ²⁴Na, ³⁹Ka, АТФ (Ходжкин, Хаксли, Катц, Шоу) показали, что именно некоторые белковые комплексы (молекулы) захватывают ионы (например, Na⁺ и переносят их против градиента концентрации (например, Na⁺ наружу и, а К⁺ внутрь клетки. Причем, этот перенос весьма специфичен (избирателен) и приводит к возникновению биопотенциалов (БП).

Как возникают БП с учетом вышеуказанного? Прежде всего отметим, что для их возникновения необходима асимметрия распределения ионов, которая обеспечивается за счет диффузии, особых свойств мембран или фазового различия. Рассмотрим сосуд с пористой перегородкой (рис.4). Пусть справа концентрация электролита H⁺Cl - больше, чем слева, тогда скорость диффузии H⁺ и Cl зависит от их подвижности (315 см²Ом^-1 и 65, 5 см²Ом^-1 г-экв соответственно). Значит в левой половине через некоторое время будет больше ионов Н⁺ и этот объем заряжается І+І.

Диффузионная разность потенциалов находится из уравнения Гендерсона

Е= , (10)

где U- подвижность катиона H⁺, V- подвижность аниона Cl , a₁, активность ионов в области, откуда идет диффузия, а₂- активность ионов в области, куда идет диффузия. Причем активность ионов от их концентрации в простейшем случае зависит линейно а=fc, где f- коэффициент активности. При различных повреждениях клеток всегда возникает диффузионный потенциал, который суммируется с потенциалом покоя (ПП) клетки. Потенциал повреждения (демаркации) можно наблюдать в яблоке при его разрезании пополам.

Частный случай диффузионного потенциала- мембранный потенциал. Если взять мембрану с большой концентрацией фиксированных отрицательных зарядов- катионобменная мембрана, то подвижность анионов Cl^- в мембране равна нулю и в правую часть сосуда диффундируют только Н⁺ до момента когда установится равновесие между силами диффузии и силами электрического поля. На мембране возникает двойной электрический слой (рис.4). Тогда, при V=0 имеет Е= , и при переходе к десятичным логарифмам при 20⁰С имеем Е=58 мВ, т.е. при изменении отношения активностей ионов в 10 раз потенциал изменяется на 58 мВ.

Если мы будем иметь 2 несмешивающиеся фазы, например, капля масла и воды с электролитом, а катионы с анионами по разному растворяются в масле, то что произойдет? Если анионы І-І лучше растворяются, то капля заряжается (как?). Отметим, что величина потенциала j определяется из уравнения Гендерсона, (10).

Рис.6 Распределение потенциала на мембране аксона кальмара

по Ходжкину-Хаксли.

В реальных биологических объектах мы имеем дело со всеми видами потенциалов, причем существенной особенностью БП является механизм, обеспечивающий разную активность ионов а₁ и а₂ во внутренней среде клетки и снаружи. Этот стабильный концентрационный градиент обеспечивается специфическими переносчиками на мембранах и требует затрат энергии, получаемой при расщеплении АТФ до АДФ. В нервных волокнах специфический механизм переноса обеспечивает повышенную концентрацию Na⁺ снаружи и К⁺ внутри. Диффузия К⁺ обеспечивает І+І на мембране, а анионы Cl^- остающиеся внутри І-І.(см. рис.5)

Проникновение Na⁺ внутрь клеток по концентрационному градиенту приводит к некоторому уменьшению мембранного потенциала. Наконец, диффузия внутрь дает некоторое увеличение потенциала. Окончательно имеем:

Эта величина мембранного потенциала Е неплохо согласуется с опытом, например, для гигантских аксонов кальмаров и для некоторых других клеток. Однако картина резко усложняется при снижении мембранного потенциала до некоторого порогового значения Е_п. В этом случае возможно возникновение потенциала действия (ПД), который сопровождается первоначально резким падением проницаемости для Na⁺.

В заключение надо отметить, что потенциалы покоя ПП- необходимый элемент жизнедеятельности любого растительного объекта. ПП являются необходимым элементом фотосинтеза и обеспечения градиентов концентраций в растительных объектах. Знание теоретических основ возникновения ПП необходимо любому экологу, ботанику, морфологу. В настоящей работе предлагается произвести измерения ПП ряда растительных объектов.

Методические указания по 3-му этапу:

“Получение зачета по лабораторной работе”

После выполнения 1 и 2 этапов обучаемый должен заполнить протокол и подписать его у преподавателя, а затем оформить зачет в тетради, обратив особое внимание на количественное и качественное объяснение наблюдаемых изменений БП (целесообразно использовать ЭВМ для первичной статистической обработки) и отчитаться у преподавателя за всю работу. В этом случае обучаемый получает зачет.

Лабораторная работа № 2.3

МОДЕЛИРОВАНИЕ БИОЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ

ФОРМАЛЬНОГО НЕЙРОНА

Цель работы

Ознакомиться с проявлением пороговых свойств нейронов и динамикой генерации потенциала действия на математической модели.

Обучающийся должен знать:

1. механизм генерации потенциалов покоя (ПП) и потенциалов действия (ПД) в растительных и животных клетках;

2. основы теории Блейра, Рашевского, Ходжкина- Хаксли

Обучающийся должен уметь:

1. Смоделировать на ЭВМ динамику изменения потенциала на мембране при E< h и E> h;

2. Изучить влияние параметров модели (нейрона) на генерацию ПД.

Практическое значение. Возникновение ПД в генераторных структурах обеспечивает двигательную, мыслительную и другие функции животного организма. В растительных клетках ПД обеспечивает многие процессы жизнедеятельности (рост, развитие, таксис и пр.) Знание основных механизмов генерации ПД и зависимость процессов генерации ПД от параметров клеток помогает понимать характер нормального и патологического состояния как животного, так и растительного организма. В этой связи изучение теории данной работы и её выполнение- ключевой момент в изучении многих процессов жизнедеятельности животных и растительных организмов. Успешное выполнение работы формирует у биолога и медика базовые знания в области теоретической биофизики.