Лекция № 14

Рекомбинантты ДНҚ туралы тү сінік

Жоспары:

1.ДНҚ рестрикциясы. Рестриктазалар, олардың тү рлері, қ асиеті жә не ДНҚ -ғ а ә сер ету ерекшеліктері.

2.Рестрикциялық карта қ ұ ру. Генді клондау. Геном кітапханасын қ ұ ру. 3.Плазмидтердің қ асиеттері жә не қ ызметтері. Плазмидті векторлар. 4.Клонындалғ ан ДНҚ -ның фрагменттерінің тізбегін анық тау. Нуклеин қ ышқ ылдарының гибридизациясы, оның мү мкіндіктері.

5.ДНҚ -зондтар. Блоттинг, оның тү рлері. Саузерн-блот талдау. Нозерн-болт талдау.

6.Полимеразды тізбекті реакция (ПТР). ПТР кө мегімен гендерді синтездеу.

Лекция мә тіні:

Рестрикциялау — модификациялау қ ұ былысы 50-ші жылдары байқ алғ ан болатын. Рестрикция тоқ тату деген мағ ынаны білдіреді, ал модификация — молекуланың белгілі топтарын химиялық жолмен немесе оларғ а баска топтарды жалғ ау арқ ылы ө згерту. Рестрикция мен модификациялау қ ұ пиясын В. Арбер ашты.

Бактерияның " ө зінің " нуклеин кышқ ылын " бө тен" фагтардың (вирустардың) нуклеин қ ышқ ылынан ажырататын арнайы ферменттері болады. Рестрикция ферменттері фагтың нуклеин қ ышқ ылын ү зіп, оның клеткада кө беюіне жол бермейді. Рестриктазалармен қ атар бактерияларда метилаза деген фермент бар. Ол бактерияның ө зінің ДНҚ тізбегіндегі азоттық негіздерге белгілі мө лшерде ә рбір репликациядан кейін метил тобын (СН₃) жалғ ап, модификациялап отырады. Метилденген ДНҚ -ны рестриктаза " ө зінікі" санап оғ ан " тиіспейді". Бұ л бактериялардағ ы ө зіндік бір " иммундык жү йе" іспеттес. Дегенмен, кейде бактерия клеткасына енген фагтың кейбір нуклеин қ ышқ ылы кездейсоқ метилденіп кетеді. Осы қ ателігінен бактерияның ө зі фагтың ә серінен қ ырылып калады. Осы қ ұ былысты О. Смит, Д. Натанс жә не В. Арбер ашты. Рестриктазалар табиғ аттың ген инженериясына арнап жасағ ан таптырмас қ ұ ралы. Бактерия ә р тү рлі болғ андық тан олардың рестриктазалары ДНҚ -ны ә ртү рлі жолмен ү зеді.[Қ азір 500-ден аса рестриктаза тү рі белгілі жә не олар ДНҚ -ны бір-бірінен ө згеше 120 жерінен ү зе алады. Яғ ни зерттеуші рестриктазаны тандай отырып ДНҚ -дан қ алағ ан ферментті нсмесе генді бү лдірмей бү тін кү йінде кесіп алады.

Генді бө ліп алу мен ген ө ркенін (клондарын) алу ү шін ә ртү рлі объектілер (бактериялардан, сү тқ оректілер клеткаларынан, қ ұ стардан т. б. алынғ ан) жә не ә ртү рлі вирустар жұ қ тырылган ортада ө сірілетін ерекше ферменттер қ ұ рал ретінде пайдаланылады. Негізіндс олар ү ш тү рлі ферменттер: рестриктазалар, лигаза жә ис кері транскриптаза.

Рестриктазалар - дезоксирибонуклеазалардың ДНҚ молекуласын қ ысқ а немесе ұ зын болшектерге тіпті жеке нуклеотидтерге дейін кесетін ферменттердің бір тү рі. Рестриктазалардың ерскшеліктері ДНҚ молекуласын кез кслген жерден кеспей тек белгілі нуклеотидтер арасынан кесуінде. Ә рбір рестриктазаның тандайтын нуклеотидтср орналасу тә ртібі бар. Бұ л ә детте 4-6 жұ п нуклеотидтер, ә ртү рлі рестриктазалар ү зетін жеріндегі нуклеотидтердің қ ұ рамында айырмашылығ ы болады. Мысалы Е. соІі рестриктазасы ДНҚ молекуласын ГААТТЦ учаскесіндс ү зеді, Ват -НІ-ГГАТЦЦ учаскесінде. Қ азір ә р тү рлі рестрикта-залардың жү зден артық ө зіндік бірізділігі белгілі.

ДНК тізбегінің ұ зына бойында нуклеотидтер кездейсоқ орналасса, теө т белгілі нуклеотидтен тұ ратын жү йелілік (бірізділік) 1/256-ғ а, ал алты нуклеотидтен - 1/4096 тең болады. Сондық тан рестриктазалар ДНК-ны бірнеше жү здеген немесе мындағ ан нуклеотидтер жұ птарынан тү ратын бө лшектерге ү зеді,

Лигаза - ДНҚ -ның бос ұ штарын бір-біріне жалғ айтын фермент. Бұ л фермент қ алыпты клеткаларда ДНҚ синтезіне жә не репарация (қ алпына келу) процестеріне қ атысады, яғ ни ДНҚ молекуласының біраз бү лінген жерлерін қ алпына келтіруге қ атысады.

Кері транскриптаза - ДНҚ -полимераза тә різдес фермент. Бірақ ДНҚ -ны ДНҚ -дан емес РНҚ -дан синтездейді. РНҚ -полимеразамен салыстырғ анда ол кері бағ ытта жү мыс істейді, яғ ни ДНҚ -дан РНҚ -ғ а емес, РНҚ -дан ДНҚ -ғ а. Кері транскриптаза ферментінің қ алыпты сау клеткалары бар ма, жә не оларда ДНҚ синтезі РНҚ -да жү ре ме? Бұ л кү мә нді сү рақ ә лі толық шешілмеген. Алайда бұ л фермент, эукариоттар клеткаларында оларғ а ДНҚ арқ ылы кө бейетін РНҚ -сы бар вирустарды жұ қ тырғ аннан кейін пайда болады. Бұ л вирустардың геномы кері транскриптазаны кодтайды, соның кө мегімен ви-рустың ДНҚ -ү лгісі қ ұ рылады да, кейін вирустар молекулала-ының РНҚ -сы синтезделеді.

ДНҚ РЕКОМБИНАНТТАРЫ (БУДАН ДНҚ ЛАР)

Генетикалық рекомбинацияның мә ні - екі хромосоманың ө зара гендерімен алмасуында. Екі немесе одан кө п тұ кым қ уатын анық тауышы бар клетканың немесе организмнің пайда болуына ә кеп соғ атын кез келген процесті 1958 жылы Понтекорво рекомбинация деп атады. Міндетті тү рде сү тқ оректілердің жыныс клеткалары пайда болғ анда, мейоздың барысында гомологты хромосомалар гендсрімен алмасады (кроссинговер — айқ асу кұ былысы). Осы алмасулар ұ рпақ тарғ а берілетін тұ қ ым қ уатын белгілердің араласуын тү сіндіруге мү мкіндік бсреді.

Гендер алмасуын, сондай-ақ клеткағ а " бө тен" геиді енгізуді генетикалық рекомбинация арқ ылы in vitro — организмнен тыс жасауғ а болады.

1972 жылы П. Бергтің лабораториясында (АҚ Ш, Станфорд университеті) ең бірінші рекомбинантты деп аталатын будан ДНҚ молекуласы алынды. Оның қ ұ рамына лямбда (X) бактериофагының геномы мен 5" К40 вирус геномы кірді.

Организмнен тыс рекомбинация ә дісі, ор тү рдің ДНҚ -ларын (табиғ и немесе жасанды) бө ліп алып, оларды бір-бірімен қ осуды, содан кейін осы рекомбинантты ДНҚ -ны тірі клеткағ а енгізіп, жаң а белгінің пайда болуын мысалы, ерекше белок синтезін жү ргізуді кө здейді

Мұ ндай эксперименттердің мақ саты ДНҚ -дағ ы белгілі бір нуклеотидтер жү йелілігін " векторғ а" енгізіп, кейін клетканың ішінде жұ мыс істеткізу. ДНҚ фрагментін вектормен жалғ астыру тө мендегідей жолдармен жү ргізіледі:

1) ректрикциялық эндонуклеазалардың қ атысуымен пайда болғ ан ДНҚ -ның жабысқ ақ ұ штары арқ ылы;

2) ДНҚ -ның ә рбір тізбегіне косымша полинуклеотидтер фрагменттерін синтездеу (поли-А, поли-Т);

3) Т4-лигаза ферментінің кө мегімен тұ қ ыл ұ штарын жалғ ау. 1974 жылдан бастап рекомбинантты ДНҚ алу жұ мыстары кө птеп жү ргізілді.

Кері транскриптазаньщ кө мегімен иРНҚ молекуласында ДНҚ тізбегі синтезделеді (кДНҚ), содан кейін иРНҚ сілтінің кө мегімен алынып тасталады да ДНҚ -полимеразанын, кө мегімен ДНҚ -ның екінші тізбегі қ ұ рылады. Экзонуклеаза ферментімен ДНҚ -ның екі тізбегі де кысқ артылып, ұ штық трансфераза арқ ылы олардың ұ штарына поли-Т жү йелілігі тігіледі. Векторлық плазмиданың сақ ина ДНҚ -сын рестриктазамен кесіп желі (сызық) тү ріне келтіреді, содан кейін экзонуклеазамен қ ысқ артып, ұ штық трансферазамен поли-А жү йесін тігеді. Ең ақ ырғ ы кезең де осы ДНК, молекуласының екі типін жалғ ап будан молекулалы синтезделген геномы бар векторлык. плазмида алады. ДНҚ тізбегінің ү зілген жерлерін лигазаның кө мегімен жалғ айды. Бұ л баяндалғ ан жағ дайда векторлык.плазмидағ а қ андай ген енгізілгені белгілі. Бірақ трансгеноз жұ мыстарында кө бінесе кө птеген ДНҚ фрагменттері пайданылады, ал солардың ішінде бірлі-жарымында ғ ана " керек" ген болады. Осығ ан байланысты ген инженериясында кажет гені бар ДНҚ фрагменттерін табу жә не оны бө ліп алу ә дісінің маң ызы ө те зор. Осы керек гені бар ДНҚ бө лшегін алу ү шін " бытыра мылтық " деп аталатын тә сіл колданылады. Оның мә ні мынада: ДНҚ ферменттер аркылы кө птеген ұ сақ бө лшектерге бытыратылады, содан кейін соқ ыр тә уекелмен оны вектордың ДНҚ молекуласымен будандастырады. Осының алдында векторлық ДНҚ -ны желі тү ріне келтіру ү шін жә не жабысқ ақ ұ штар пайда болу ү шін рестриктазамен ө ң дейді. Ішек таяқ шасына рекомбинантты молекуланы кіргізгеннен соң, сұ рыптайтын қ оректік ортаның кө мегімен қ ажетті гені бар ДНҚ бө лшектері тү скен бактерияларды бө ліп алады. Кірген генді оның шығ аратын заты (фермент, гормон т.б.) арқ ылы тауып алады. Бактериялар кө бейгенде онын қ ұ рамындағ ы рекомбинантты ДНҚ еселенеді де ДНҚ ө ркендері (клондары) пайда болады.

Матрицалық Рнк негізінде оғ ан комплементарлы қ ос тізхбекті ДНК синтездеуді гибридтелу деп аталады. Бұ л кері транскрипция процесі арқ асында мү мкін болады. Ең алдымен м РНК- ның поли А ұ шын праймермен гибридтейді. Праймер бұ л жерде олигодезоксириботимидиннің қ ысқ а тізбегі болып табылады. Ол бос кү йіндегі 3 ΄ ұ шты қ алыптастыру ү шін жә не кері транскриптаза ферменті жұ мысты бастау ү шін комплементарлы жұ птастыра отырып 5′ → 3′ бағ ытында ДНК молекуласын синтездейді реакция ө німі ДНК тізбегімен комплементарлы жұ птасқ ан РНК матрица тізбегінен тұ ратын гибритті молекула. In Vitro жағ дайларында бұ л процесті жү ргізгенде жалғ ыз практикалық қ иыншылық бар. Кері транскриптаза ферменті м РНК – ның 5′ ұ шына жетпей кез- келген нү ктеде тоқ тап қ алуы мү мкін. Ал м РНК – ның 5′ ұ шына жетсе, фермент синтезделетін ДНК- ның ұ шында тұ зақ тү зеді. Яғ ни тү зілген ДНК- ның 3′ ұ шында 10-20 нуклеотид жұ бынан тұ ратын иілім пайда болады. Осы кезең де м РНК матрицаны сілтімен ө ң деу арқ ылы ыдыратады. Нә тижесінде мРНК –ғ а комплементарлы 1 тізбекті ДНК тү зілуі. Оны к ДНК деп атайды. Олардың 3′ ұ шындағ ы иілім ДНК полимераза бір ферменті ү шін праймер болып табылады. ДНК полимераза бір ДНК –ны комплементар тізбек синтездеу арқ ылы қ ос тізбекті ДНК-ғ а айналады. Реакция ө німі ұ шында иілім бар 2 тізбекті ДНК молекууласы иілімді нуклеовза

S1 ферменті арқ ылы кесіп, кә дімгі екі тізбекті ДНК алады. Оны ары қ арай синтетикалық геннің кө п мө лшерін алу ү шін клоундауғ а болады. Мұ ндай клонды кДНК клоны деп атайды. Клондау техникасы генетикалық материалдардан жеке гендерді тікелей алуғ а кө п қ олданылады.Ә рбір жеке ген эукариоттарының геномының ө те азғ антай бө лігі болып табылады. Мысалы: сү тқ оректілердің геномының мө лшері 10⁹ нуклеотид жұ бын қ ұ райды.Ал орташа гендер шамамен 5 мың нуклеотид жұ бтарынан тұ рады, яғ ни ядродан РНК-ның 0, 0005 осындай болар болмас материалды идентификациялау ү шін арнайы заттар пайдаланады. Яғ ни бұ л ә дісте таң баланғ ан радиоактивті РНК немес ДНК заттар пайдаланады. Бұ л кезде туындайтын қ иындық арнайы белокқ а сә йкес келетін мРНК алу бұ л ү шін арнайы ә діс “Гибрид тұ ншық тыратын трансляция ә дісі пайдаланады” Бұ л ә дістің негізінде кДНК –ның м РНК-ның гибридтеліп, оның трансляциясына кеергі келтіру, қ асиеті жатады. Бұ рынғ ы уақ ыттарда гендерді бө ліп алуда мРНК пайдаланғ ан, Ал қ азіргі уақ ытта химиялық тұ рақ ты кДНК пайдаланады. ДНК-ны бір тізбекті фрагменттенрге денатурациялап, одан соң тү зілген фрагменттерді фильтрге ауыстырады. Сол кезде олар имобилизацияланады. Бұ л сарғ ыш қ ағ азбен, су сің іруге ұ қ сайды. Осы ә дісті ойлап тапқ ан ғ алымдардың атымен Саузерн блоттинг деп аталады. Нитроцелилозамен имобилизацияланғ ан фрагменттерді радиоактивті зондпен In Vitro жағ дайларында гибридтеуге болады. Бұ л жағ дайда ә діс Нозерн Блотинг деп аталады.

Бү кіл геномдардың ДНК-рын клондауды Шотган эксперимент деп атайды.Бұ л ү шін геномды қ олайлы фрагменттерге бө леді.Одан соң фрагменттерді клондалатын векторғ а тіркесіп, химералық векторлар алады. Осындай фрагменттер жинағ ын геном библиотекасы деп атайды. Осындай жолмен алынғ ан бактериофагтардың немесе плазмидалық векторды шексіз ұ зақ уақ ыт сақ тауғ а болады. Осы белоктардан бір-бірін клонды селекциялап, іріктеп алу ү шін гибридтеу ә дісі қ олданылады. ′