Результаты и обсуждение. Результаты определения цитокинов и факторов роста представлены в табл

Результаты определения цитокинов и факторов роста представлены в табл. 1 и 2.

Таблица 1. Концентрация цитокинов и факторов роста в клеточных препаратах и образцах клеточных лизатов (пг/мл, М±sd, в скобках – число наблюдений)

н/о – концентрация не определяется; «–» – измерение не проводилось;

*– достоверное различие с контрольным КП (p< 0, 05)

** – достоверное различие с плазмой (p< 0, 05)

Как видно из табл. 1, в сывороточной части КП присутствовали в высокой концентрации цитокины ФНО-α, ИЛ-1, -6, -8, ИФ-α, уровень ИЛ-4, ИФ-γ и TGF-β 1, TGF-β 2, PDGF-AB, VEGF был в пределах того, что регистрируется в сыворотке. В сывороточной части «контрольного» КП присутствовала высокая концентрация ИЛ-8, уровень ИЛ-4, ИФ-γ, TGF-β 1, TGF-β 2, PDGF-AB, VEGF был также в пределах сывороточного, концентрации ИЛ-1, -6 и ФНО-α были на минимальном уровне, содержание ИФ-α было меньше, чем в сывороточной части КП. Таким образом, добавление стимулятора полиА: У при получении КП приводило к TLR-опосредованной активации клеток и синтезу провоспалительных цитокинов ФНО-α, ИЛ-1, -6 и ИФ-α. На уровень ИЛ-4, -8, ИФ-γ и факторов роста добавление стимулятора не влияло.

Таблица 2. Концентрация цитокинов и факторов роста в плазме и сыворотке крови (пг/мл, М±sd, в скобках – число наблюдений)

н/о – концентрация не определяется;

* – достоверное различие с плазмой (p< 0, 05)

Из табл. 2 видно, что в свежеполученной плазме и сыворотке крови присутствовали такие же концентрации ИФ-γ и ИЛ-4 и факторов роста TGF-β 1, TGF-β 2, PDGF-AB, VEGF, как в сывороточной части «контрольного» КП; концентрации ИЛ-8, ФНО-α, b-FGF были на минимальном уровне; ИЛ-1, -6 – не определялись.

Сыворотка отличалась от плазмы по своему цитокиновому составу: концентрации ИФ-α, ИЛ-8, TGF-β 2, PDGF-AB, VEGF были больше, чем в плазме, концентрации ИЛ-4 и ИФ-γ – меньше. Однако, такие различия находятся в пределах среднестатистических показателей для жителей России.

ИЛ-2, -10, -17 не были определялены ни в КП, ни в контрольных образцах. Вероятно, в данных условиях было недостаточно времени или стимулирующих факторов для синтеза этих цитокинов.

В образцах лизатов лейкоцитов в плазме концентрация ИЛ-8 была выше, чем в бесклеточной плазме, из чего можно заключить, что этот цитокин присутствует в депонированной форме в лейкоцитах периферической крови. В сывороточной части КП концентрация ИЛ-8 была выше, чем в лизате лейкоцитов в плазме. Это значит, что его наличие в КП опосредовано не только дегрануляцией депонированного ИЛ-8, но и синтезом этого цитокина de novo во время инкубации. Концентрация ИЛ-8 в лизате стимулированных лейкоцитов КП не отличалась от концентрации в лизате нестимулированных лейкоцитов «контрольного» КП. Следовательно, стимуляция клеток с помощью полиА: У не влияет на синтез лейкоцитами ИЛ-8, и увеличение его концентрации инициируется другими условиями процессинга. Различия в концентрации ИЛ-8 между образцами сывороточной части КП и лизатом лейкоцитов КП отсутствовали, что свидетельствует о том, что через 4 ч инкубации синтез этого цитокина практически завершен.

В образцах лизатов лейкоцитов в плазме присутствовал ФНО-α, его концентрация была выше, чем в бесклеточной плазме. Следовательно, ФНО-α на момент лизиса был депонирован в лейкоцитах. Во время процессинга происходило его внутриклеточное накопление за счет синтеза во время инкубации, о чем свидетельствует его повышенная концентрация в лизатах лейкоцитов КП (как стимулированных, так и нестимулированных). Отсутствие достоверных концентрационных различий в образцах лизатов стимулированных и нестимулированных лейкоцтов в КП указывает на то, что синтез ФНО-α, также как и ИЛ-8 был инициирован условиями процессинга, а не стимуляцией полиА: У. Однако, следует отметить, что присутствие стимулятора обеспечивало высвобождение из клеток вновь синтезированного ФНО-α. Это подтверждается тем, что в сывороточной части КП концентрация ФНО-α была значительно выше, чем в сывороточной части «контрольного» КП. Различия в концентрации ФНО-α между сывороточной частью и лизатом стимулированных лейкоцитов КП отсутствовали, то есть через 4 ч инкубации со стимулятором синтез клетками этого цитокина и его выделение завершались.

Таким образом, механизм появления ИЛ-8 и ФНО-α в КП следующий – эти цитокины выделяются из внутриклеточных депо за время инкубации, кроме того, часть синтезируется de novo, однако на уровень их синтеза полиА: У не влияет, однако, он усиливает высвобождение из клеток синтезированного ФНО-α.

Из анализа полученных результатов можно заключить, что цитокиновый профиль КП формируется за счет цитокинов:

1. выделенных в ответ на стимуляцию полиА: У(ИЛ-1, -6, ФНО-α, ИФ-α);

2. спонтанно синтезированных за время инкубации (ИЛ-8),

3. предсуществующих в плазме и сыворотке крови (TGF-β 1, PDGF-AB, TGF-β 2, VEGF, ИФ-γ и ИЛ-4).

Наличие широкого спектра цитокинов и факторов роста в составе сывороточной части КП позволяет рассматривать её в качестве отдельного терапевтического инструмента. Мы обозначили эту часть клеточного препарата как ПАС – процессированная аутологичная сыворотка. Она используется в качестве самостоятельного терапевтического препарата для лечения болезней роговицы.

Концентрации TGF-β 1, PDGF-AB и VEGF в КП на порядок превышают их физиологические концентрации в водянистой влаге передней камеры глаза, обеспечивающие в норме нерепликативное состояние эндотелиоцитов. В экспериментальных исследованиях in vitro указанные факторы роста применяют для стимуляции пролиферации эндотелия роговицы в концентрациях, превышающих физиологические [22–25]. При проведении интраоперационной ПКТ водянистая влага передней камеры глаза заменяется на КП, содержащий лейкоциты и процессированную аутологичную сыворотку. Тем самым изменяется микроокружение эндотелиоцитов и обеспечивается цитопротективный и регенеративный эффект. Можно предположить, что в данном случае in vivo наблюдаются явления, аналогичные полученным в культуре эндотелиоцитов: PDGF ускоряет заживление раневого дефекта; TGF-β 1 приводит к стимуляции пролиферации клеток, усилению продукции коллагена и выработке эндогенного b-FGF эндотелиоцитами, который, в свою очередь, защищает клетки от апоптоза; VEGF стимулирует миграцию эндотелиоцитов в зону повреждения.

Значение провоспалительных цитокинов в патогенезе заболеваний роговицы традиционно связывают с развитием воспалительных реакций, так как их уровень во влаге передней камеры неизбежно повышается при развитии патологического процесса [26]. Однако повышение содержания провоспалительных цитокинов может быть и элементом регенерации. Так, ФНО-α регулирует процессы фиброгенеза в поврежденной роговице, ИЛ-1 индуцирует синтез b-FGF эндотелиоцитами после деструкции роговицы [27, 28]. Провоспалительные цитокины ослабляют межклеточные контакты между эндотелиоцитами, чем, предположительно, стимулируют пролиферативную активность эндотелия роговицы, снимая один из механизмов ингибирования митоза [29]. Все вышеозначенные процессы приводят к наблюдаемому эффекту – восстановлению барьерной функции эндотелия роговицы. Установлено, что лейкоциты, введенные в переднюю камеру глаза, находятся там в течение недели [30]. После интракамеральной инъекции КП начавшиеся in vitro процессы синтеза и продукции цитокинов продолжаются in vivo, таким образом обеспечивается пролонгированное локальное высвобождение биологически активных веществ, обусловливающих клинический эффект ПКТ.

Результаты определения цитокинового спектра КП позволили разработать схему предполагаемого механизма лечебного действия ПКТ (рис.1).

Рисунок 1. Предполагаемые цитокиновые механизмы реализации лечебных эффектов ПКТ.

Выделившиеся в результате стимуляции полиА: У провоспалительные цитокины, вкупе с ИЛ-8, ослабляют межклеточные контакты, чем снимают контактное ингибирование митоза, позволяя эндотелиоцитам поделиться или мигрировать и закрыть зону дефекта. Антиапоптотическому эффекту способствует наличие факторов роста, концентрация которых в водянистой влаге в норме снижена, они, кроме того, усиливают синтез внеклеточного матрикса, что стабилизирует барьерную функцию эндотелия. Прямой противовирусный эффект обеспечивается наличием в КП ИФα.

Выводы

1. в клеточном препарате содержится широкий спектр цитокинов,

2. стимуляция клеток при помощи полиА: У приводит к повышению концентрации в клеточном препарате ИЛ-1, -6, ФНО-α, ИФ-α,

3. в процессе получения клеточного препарата спонтанно синтезируется интерлейкин-8,

4. в свежеполученной сыворотке и плазме крови предсуществуют факторы роста TGF-β 1, PDGF-AB, TGF-β 2, VEGF, ИФ-γ и ИЛ-4,

5. стимуляция клеток при помощи полиА: У и условия инкубации клеточного препарата не повышают концентрацию TGF-β 1, PDGF-AB, TGF-β 2, VEGF, ИФ-γ и ИЛ-4 по сравнению с предсуществующим уровнем.

Список литературы

1. Аветисов С.Э., Суббот А.М., Антохин А.И., Каcпарова Е.А., Каспаров А.А., Павлюк А.С. Персонализированная клеточная терапия в офтальмологии. I. Метод получения и цитофенотип аутологичного клеточного продукта // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2011. Т. 6. № 2. С. 38-42.

2. Каспаров А.А. Офтальмогерпес. М. 1994, 224 с.

3. Каcпарова Е.А., Суббот А.М., Антохин А.И., Павлюк А.С. Клиническая эффективность персонализированной клеточной терапии заболеваний эндотелия роговицы. // Катарактальная и рефракционная хирургия. 2011. Т. 11 № 2. С. 45-49.

4. Gnecchi M, Zhang Z, Ni A, Dzau VJ. Paracrine mechanisms in adult stem cell signaling and therapy // Circ. Res. 2008. Т. 103. № 11. P. 1204-1219.

5. Maltais S, Tremblay JP, Perrault LP, Ly HQ. The paracrine effect: pivotal mechanism in cell-based cardiac repair // J Cardiovasc Transl Res. 2010. Т. 3. № 6. P. 652-662.

6. Patel S.A., Rameshwar P. Stem Cell Transplantation for Hematological Malignancies: Prospects for Personalized Medicine and Co-therapy with Mesenchymal Stem Cells // Current Pharmacogenomics and Personalized Medicine. 2011. Т. 9. № 3. P. 229-239.

7. Horwitz E.M., Prather W.R. Cytokines as the major mechanism of mesenchymal stem cell clinical activity: expanding the spectrum of cell therapy // Isr. Med. Assoc. J. 2009. Т. 11. № 4. P. 209-211.

8. Loffredo FS, Steinhauser ML, Gannon J, Lee RT. Bone marrow-derived cell therapy stimulates endogenous cardiomyocyte progenitors and promotes cardiac repair // Cell Stem Cell. 2011. Т. 8. № 4. P. 389-398.

9. Song S.-Y., Chung H.-M., Sung J.-H. The pivotal role of VEGF in adipose-derived-stem-cell-mediated regeneration // Expert Opin Biol Ther. 2010. Т. 10. № 11. P. 1529-1537.

10. Хорошилова-Маслова И.П., Илатовская Л.В., Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Константинова Н.А., Бахтулова М.Е., Радыгина Т.В. Регуляция цитокинами постожоговой регенерации роговицы в эксперименте // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1999. № 3. С. 314-316.

11. Imanishi J, Kamiyama K, Iguchi I, Kita M, Sotozono C, Kinoshita S. Growth factors: importance in wound healing and maintenance of transparency of the cornea // Prog Retin Eye Res. 2000. Т. 19. № 1. P. 113-129.

12. Siqueira RC, Voltarelli JC, Messias AM, Jorge R. Possible mechanisms of retinal function recovery with the use of cell therapy with bone marrow-derived stem cells // Arq Bras Oftalmol. 2010. Т. 73. № 5. P. 474-479.

13. Torres P.F., Kijlstra A. The role of cytokines in corneal immunopathology // Ocul. Immunol. Inflamm. 2001. Т. 9. № 1. P. 9-24.

14. Слепова О.С., Герасименко В.А., Макаров В.П., Кушнир В.Н., Захарова Г.Ю., Быковская Г.Н., Варданян И.Р. Сравнительное исследование роли цитокинов при разных формах глазных заболеваний. Сообщение 1.Фактор некроза опухоли альфа // Вестник офтальмологии. 1998. № 3. С. 28-32.

15. Erdem U, Kerimoglu H, Gundogan FC, Dagli S. Treatment of Mooren’s ulcer with topical administration of interferon alfa 2a // Ophthalmology. 2007. Т. 114. № 3. P. 446-449.

16. Гулиева М.Г. Эффективность Офтальмоферона в комбинированном противовирусном лечении тяжелого стромального герпетического кератита // Рефракционная хирургия и офтальмология. 2006. Т. 6. № 4. С. 48-52.

17. Джамбинова Н.С., Гусева М.Р., Сидоренко Е.И., Ганковская Л.В., Ковальчук Л.В., Федоров А.А., Горбунова Е.Д., Кузнецова Ю.Д. Цитокинотерапия в регуляции репаративных процессов роговицы (экспериментально-клиническое исследование) // Вестник офтальмологии. 2009. № 6. С. 18-21.

18. Poon AC, Geerling G, Dart JK, Fraenkel GE, Daniels JT. Autologous serum eyedrops for dry eyes and epithelial defects: clinical and in vitro toxicity studies // Br J Ophthalmol. 2001. Т. 85. № 10. P. 1188-1197.

19. Geremicca W., Fonte C., Vecchio S. Blood components for topical use in tissue regeneration: evaluation of corneal lesions treated with platelet lysate and considerations on repair mechanisms // Blood Transfus. 2010. Т. 8. № 2. P. 107-112.

20. Ченцова Е.В. Фетотерапия эндотелиально-эпителиальной дистрофии роговицы // Материалы научно-практической конференции актуальные вопросы офтальмологии, Москва, 2000, №2, с.155-157.

21. Kawai T., Akira S. TLR signaling // Semin. Immunol. 2007. Т. 19. № 1. P. 24-32.

22. Tripathi RC, Borisuth NS, Li J, Tripathi BJ. Growth factors in the aqueous humor and their clinical significance // J. Glaucoma. 1994. Т. 3. № 3. P. 248-258.

23. Hoppenreijs VP, Pels E, Vrensen GF, Treffers WF Effects of platelet-derived growth factor on endothelial wound healing of human corneas // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1994. Т. 35. № 1. P. 150-161.

24. Rieck PW, Gigon M, Jaroszewski J, Pleyer U, Hartmann C. Increased endothelial survival of organ-cultured corneas stored in FGF-2-supplemented serum-free medium // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2003. Т. 44. № 9. P. 3826-3832.

25. Bednarz J, Thalmann-Goetsch A, Richard G, Engelmann K. Influence of vascular endothelial growth factor on bovine corneal endothelial cells in a wound-healing model // Ger J Ophthalmol. 1996. Т. 5. № 3. P. 127-131.

26. Шаимова В.А. Роль провопалительных цитокинов при заболеваниях глаз // Цитокины и воспаление. 2005. Т. 4. № 2. С. 13-15.

27. Saika S. Yin and yang in cytokine regulation of corneal wound healing: roles of TNF-alpha // Cornea. 2007. Т. 26. № 9 Suppl 1. P. S70-74.

28. Song J.-S., Lee J.G., Kay E.P. Induction of FGF-2 synthesis by IL-1beta in aqueous humor through P13-kinase and p38 in rabbit corneal endothelium // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2010. Т. 51. № 2. P. 822-829.

29. Joyce N.C., Harris D.L., Mello D.M. Mechanisms of mitotic inhibition in corneal endothelium: contact inhibition and TGF-beta2 // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2002. Т. 43. № 7. P. 2152-2159.

30. Yamamoto T, Goto H, Yamakawa N, et al. Kinetics of polymorphonuclear leukocytes in an experimental hypopyon model // Exp. Eye Res. 2010. Т. 91. № 5. P. 685-690.

Директор НИИ глазных болезней РАМН, член-корр РАМН, профессор, д.м.н. Аветисов Сергей Эдуардович

Н.с. лаборатории морфологической диагностики, консервации тканей и клеточных технологий НИИ глазных болезней РАМН, аспирант кафедры биологии МБФ РНИМУ им Н.И. Пирогова Суббот Анастасия Михайловна

Заведующий кафедрой биологии МБФ РНИМУ им Н.И. Пирогова, профессор, д.б.н. Антохин Александр Иванович

Н.с. отдела патологии роговицы НИИ глазных болезней РАМН, к.м.н. Каспарова Евгения Аркадьевна

Заведующий отделом патологии роговицы НИИ глазных болезней РАМН, академик РАЕН, профессор, д.м.н. Каспаров Аркадий Александрович

Доцент кафедры иммунологии МБФ РНИМУ им Н.И. Пирогова, к.м.н., в.н.с. лаборатории морфологической диагностики, консервации тканей и клеточных технологий НИИ глазных болезней РАМН Павлюк Александр Сергеевич

Для переписки:

Суббот Анастасия Михайловна

Тел. 8-499-246-87-84 (рабочий), 8-926-280-13-48 (мобильный),

e-mail: kletkagb@gmail.com