И область ее применения в биотехнологии

Генетическая инженерия является основой биотехнологии. Гене­тическая инженерия по существу сводится к генетической ре­комбинации, т.е. обмену генами между двумя хромосомами, ко­торая приводит к возникновению клеток или организмов с двумя и более наследственными детерминантами (генами), по которым родители различались между собой. Метод рекомбинации заклю­чается в следующем:

А выделение ДНК из разных видов организмов или клеток;

А получение гибридных молекул ДНК;

А введение рекомбинантных (гибридных) молекул в живые клетки;

А создание условий для экспрессии и секреции продуктов, ко­дируемых генами.

Гены, кодирующие те или иные структуры, выделяются (кло­нируются) из хромосом или плазмид, прицельно выщепляются

из этих генетических образований с помощью ферментов рест­рикции или синтезируются химически. Набор ферментов (изве­стно более 500 рестриктаз), способных резать ДНК по опреде­ленным связям (сайтам), является важным инструментом гене­тической инженерии. В последнее время обнаружены ферменты, расщепляющие по определенным связям РНК наподобие рест­рикции ДНК. Эти ферменты названы рибозимами. Их роль еще пока не выяснена.

С помощью химического синтеза могут быть получены срав­нительно небольшие гены. Для этого вначале расшифровывают число и последовательность аминокислот в белковой молекуле вещества и по этим данным узнают очередность нуклеотидов в гене, поскольку каждой аминокислоте соответствуют три нук-леотида (кодон). С помощью синтезатора создают химическим пу­тем ген, аналогичный природному гену.

Полученный целевой ген с помощью ферментов лигаз сши­вают с другим геном, который используется в качестве вектора для встраивания гибридного гена в клетку. В качестве вектора могут служить плазмиды, бактериофаги, вирусы человека, жи­вотных и растений.

Количество плазмид в бактериальной клетке может колебаться от одной до нескольких сотен, причем чем большие размеры имеет плазмида, тем меньше ее копий в клетке. С помощью ам-пфликации генов, т. е. увеличения числа копий определенного гена в клетке, можно резко повысить производство кодируемо­го вещества клеткой. Ампфликацией удается добиться получения до 3000 копий плазмидных генов на клетку.

Бактериофаг как вектор используется аналогично. Целевой ген встраивается в геном фага, реплицируется вместе с генами ви­руса при размножении последнего в бактериальной клетке. Чаще всего используется фаг ламбда, который содержит ДНК, состо­ящую из 50 тыс. пар нуклеотидов. Преимущество фага ламбда пе­ред плазмидами в том, что фаговый вектор позволяет клониро­вать большие фрагменты чужеродной ДНК.

В случае использования в качестве векторов вирусов челове­ка, животных и растений чужеродный ген встраивают в ДНК вируса, и он реплицируется вместе с размножением последнего в клетке. Применяют в качестве вектора космиды, представляю­щие собой гибрид плазмиды с фагом. Космиды используются для клонирования больших (до 45 тыс. пар нуклеотидов) фрагмен­тов ДНК эукариот.

Для РНК-содержащих вирусов передача генетической инфор­мации возможна с помощью ревертазы (обратной транскрипта-зы), передающей информацию о структуре белка от РНК к ДНК, которая является комплементарной иРНК.

На рис.6.1 показана принципиальная схема получения реком-

ДНК 2

ДНК1

Целевой ген

Целевой Ш^РестР^иктазД +

Клонированный или химически синтезированный целевой ген

'Плазмида

Рис.6.1. Получение рекомбинантных ДНК и рекомбинантных штаммов микроорганизмов (схема).

бинантных молекул ДНК и рекомбинантных бактерий. Экспрес-сируемый ген в виде рекомбинантной ДНК (плазмида, фаг, кос-мида, вирусная ДНК) встраивается в бактериальную или жи­вотную клетку, которая приобретает новое свойство — способ­ность продуцировать не свойственное этой клетке вещество, ко­дируемое экспрессируемым геном. Для лучшего проникновения вектора через стенку бактерий иногда прибегают к воздействию на стенку (например, хлоридом кальция), чтобы увеличить ее проницаемость.

В качестве реципиентов экспрессируемого гена чаще всего ис­пользуют Е. coli, В. subtilis, псевдомонады, дрожжи, вирусы. Ре­ципиента подбирают не только с учетом возможности встройки чужеродного гена, но и уровня выраженности (экспрессии) син­теза вещества, кодируемого геном, возможности его секреции в окружающую среду, легкости и доступности массового культи­вирования, экологической безопасности. Некоторые штаммы ре­комбинантных бактерий способны переключать на синтез чуже­родного вещества, экспрессируемого геном, до 50 % своего син­тетического потенциала. Такие штаммы — суперпродуценты це­левых продуктов — уже получены и применяются в биотехно­логической промышленности; они носят название промышлен­ных штаммов. В качестве примера можно привести штаммы — суперпродуценты интерферона, интерлейкина, белков ВИЧ и др.

Некоторые штаммы микроорганизмов хорошо экспрессируют чужеродные гены, но плохо секретируют продукт в окружаю­щую среду. В таких случаях приходится применять дезинтефацию (разрушение) клетки с целью высвобождения из нее синтези­рованного продукта.

В некоторых случаях, несмотря на наличие экспрессии и сек­реции, продукт не удается получить, вернее собрать, из-за раз­рушения в процессе синтеза или после него протеазами и дру­гими ингибиторами. Это прежде всего относится к низкомоле­кулярным пептидам.

С целью повышения уровня секреции целевого белка пользуются следующим приемом: к гену целевого белка при­соединяют ген белка, хорошо секретируемого клеткой реци­пиента. Образующийся в результате такой манипуляции хи­мерный белок, хорошо секретируемый клеткой, собирают и от него отщепляют целевой белок. Возможно также к гену це­левого белка присоединить ген-индикатор, т. е. ген, кодиру­ющий легко узнаваемый белок, в результате чего получают химерный индикаторный белок, а из него — целевой белок. В качестве индикатора можно использовать, например, галак-тозидазу.