Горизонтальный электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле.

Электрофоретическая подвижность нуклеиновых кислот в агарозном геле обусловлена их сильным отрицательным зарядом. Благодаря этому, ДНК и РНК в электрическом поле мигрируют к положительно заряженному электроду (аноду). Из-за достаточно большого размера пор агарозного геля, фрагменты ДНК и РНК меньшего размера мигрируют быстрее, чем их б о льшие фрагменты. Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле обычно проводят с помощью специальных приборов, в состав которых входит планшет и столик для заливки геля, гребенка для формирования лунок, а также камера, содержащая электроды, в которой под слоем буфера осуществляется проведение электрофореза.

Буферные системы. Для проведения электрофореза в агарозном геле обычно используют два буфера – TAE (трис-ацетатный буфер) и TBE (трис-боратный буфер). Для проведения электрофореза ДНК, можно использовать любой из этих буферных растворов, однако, если ДНК в последствие будет экстрагирована из геля и использована для клонирования, то рекомендуется проводить электрофоретическое разделение в ТАE-буфере, так как борат, содержащийся в TBE, является сильным ингибитором ДНК- модифицирующих ферментов. По этой же причине в случае электрофореза РНК в основном используют TBE, так как он может оказывать ингибирующее действие на РНКазы.

Агарозный гель и его процентность. Агарозный гель готовят на буфере, в котором происходит электрофоретическое разделение фрагментов ДНК. В зависимости от целей эксперимента процентность агарозы в геле составляет 0.3% – 2.0%. Выбор процентности геля в основном зависит от размера разделяемых фрагментов (см. табл.1), а также от того, в какой форме находится молекула ДНК – кольцевой или линейной. Обычно кольцевые молекулы ДНК мигрируют в геле в виде трех полос, каждая из которых соответствует релаксированной, скрученной и суперскрученой изоформам молекулы ДНК. Чем выше степень скрученности молекулы ДНК, тем быстрее ее подвижность. Линейные молекулы ДНК мигрируют в геле в виде единственной полосы, подвижность которой в геле на 30% - 40% быстрее, чем подвижность скрученной молекулы ДНК.

Таблица 1. Выбор процентности агарозного геля при электрофоретическом разделении линейных молекул ДНК.

Нанесение образцов на гель. Нанесение исследуемых образцов ДНК в агарозном геле обычно проводят в специальном буфере, в состав которого входят ЭДТА для ингибирования метал-зависимых нуклеаз, сахароза или глицерин для утяжеления образца, препятствующего его диффузии из лунок, а также несколько электрофоретических красителей: бромфеноловый синий, ксилен цианол, а также Orange G. Каждый из вышеперечисленных красителей имеет свою электрофоретическую подвижность, что позволяет следить за течением электрофореза и разделением фрагментов ДНК в исследуемом образце. Следует заметить, что электрофоретическая подвижность красителей сильно зависит от процентности агарозного геля. При проведении электрофореза в 1% агарозном геле в TAE/TBE буфере подвижность бромфенолового синего эквивалентна подвижности фрагмента ДНК размером 4160 bp/3030 bp, подвижность ксиленцианола - 370 bp/220 bp, а подвижность Orange G – менее 50 bp в обоих буферах, соответственно. В случае электрофореза РНК буфер нанесения дополнительно содержит формамид и SDS – реагенты, денатурирующие вторичную структуру РНК.

Способы детекции. Наиболее распространенным реагентом для детекции нуклеиновых кислот в агарозном геле является бромистый этидий (EtBr). Бромистый этидий представляет собой реагент, который взаимодействует с ДНК/РНК, встраиваясь между парами азотистых оснований, и флюоресцирует при ультрафиолетовом излучении оранжевым светом (см. рис.3). Максимум флуоресценции бромистого этидия составляет около 300 нм. Интенсивность флуоресценции возрастает в 20 раз при связывании реагента с ДНК. Бромистый этидий встраивается в ДНК/РНК количественно, т.е. чем меньше фрагмент ДНК, тем слабее он будет виден на геле. При проведении электрофореза бромистый этидий добавляют непосредственно в расплавленную агарозу. Рабочая концентрация бромистого этидия составляет приблизительно 0.5 мкг на мл агарозного геля. Не следует использовать слишком высокие концентрации бромистого этидия, так как это может препятствовать визуализации фрагментов ДНК/РНК небольшого размера или в низкой концентрации. Бромистый этидий имеет положительный заряд и мигрирует в электрическом поле к катоду (отрицательно заряженному электроду), поэтому при длительном проведении электрофореза следует добавлять бромистый этидий в буфер разделения. Следует обратить особое внимание на то, что бромистый этидий токсичен и является канцерогеном и мутагеном. Работать с бромистым этидием желательно в нитриловых перчатках (через них бромистый этидий не проникает) и после работы мыть руки с мылом. Минимальное количество ДНК, которое можно детектировать с помощью бромистого этидия, составляет 5-10 нг в полосе.

Рис.3. Структурные формулы бромистого этидия (слева) и SYBR green (справа).

Альтернативным способом детекции ДНК в агарозном геле является реагент SYBR green I (см. рис.3). Этот реагент также взаимодействует с ДНК. Комплекс ДНК-SYBR green при 300 нм флуоресцирует зеленым светом. В отличие от бромистого этидия SYBR green не является мутагеном, но, как любое вещество, способное взаимодействовать с ДНК, является канцерогеном. SYBR green позволяет детектировать двуцепочечную ДНК в количестве 1-2 нг, т.е. является гораздо более чувствительным красителем, чем бромистый этидий. Следует заметить, что SYBR green не добавляют непосредственно в расплавленную агарозу, а проводят окрашивание геля после проведения электрофореза.

Условия проведения. Среднее напряжение электрического поля при проведении электрофореза в агарозном геле составляет 6-8 V/см геля. Не следует проводить электрофорез при более высоком напряжении, так как это способствует: 1) усилению диффузии при повышении температуры и ухудшению качества электрофореза (особенно в случае низкомолекулярных фрагментов ДНК), 2) более быстрой потере бромистого этидия из геля.

Применение агарозного гель-электрофореза. Агарозный электрофорез используют в генной инженерии для 1) аналитических целей (разделения фрагментов ДНК, контроля целостности препаратов ДНК и РНК после выделения, выявления наличия ПЦР-продукта после проведения ПЦР), 2) для препаративных целей: вычленения конкретного фрагмента ДНК и его последующей экстракции из геля, 3) для определения концентрации ДНК и РНК в исследуемом образце.