Трансформация E.coli

Процесс проникновения плазмидной ДНК в бактериальную клетку называется трансформацией. В естественных условиях бактериальные клетки не способны к поглощению ДНК. Это связано, прежде всего, с прочной клеточной стенкой, состоящей из пептидогликанов, которую имеет клетка E.coli, а также с отрицательным зарядом ее внешней мембраны, в состав которой входят фосфолипиды и липополисахариды. Поскольку молекула ДНК также заряжена отрицательно, то ее проникновение в бактериальную клетку становится проблематичным по механическим и электростатическим причинам. Для решения этой проблемы было разработано три метода трансформации: химическая трансформация, электропорация и трансформация с помощью минералов(см презентацию). В первом случае для того, чтобы проникновение ДНК в клетку стало возможным, необходимо подготовить бактериальные клетки к поглощению ДНК, т.е. сделать их компетентными. Для этого клетки E.coli обрабатывают раствором бивалентных катионов (Ca²⁺, Mg²⁺, Rb⁺, Mn ²⁺) при низких температурах. Это приводит с одной стороны к снижению общего отрицательного заряда поверхности бактериальной клетки E.coli, а с другой стороны меняет подвижность фосфолипидного бислоя (он становится менее подвижным). Некоторые протоколы приготовления компетентных клеток включают в себя обработку клеток такими веществами, как PEG и DMSO. Было показано, что в присутствие этих веществ трансформация проходит гораздо эффективнее. Возможно, это связано с тем, что добавление этих веществ увеличивает общую вязкость раствора и стерически облегчает взаимодействие клеток и ДНК. Кроме этого, эти вещества являются криопротекторами, т. е. обеспечивают хранение готовых препаратов компетентных клеток при отрицательных температурах.

Сама процедура химической трансформации состоит из трех основных стадий. В начале компетентные клетки инкубируют на льду с ДНК. На этой стадии ДНК «прилипает» к бактериальной клеточной стенке, благодаря взаимодействию с бивалентными катионами, которые служат связующим звеном между клеткой и ДНК.

Вторая стадия заключается в очень кратком (от 30-40c или до минуты) тепловом шоке при 42°С. На этой стадии из-за резкого повышения температуры текучесть фосфолипидного бислоя резко увеличивается, в мембранах бактериальных клеток появляются поры, через которые ДНК проникает в клетку. Очень важно после проведения теплового шока сразу охладить смесь клеток с ДНК на льду, поскольку при температурах 40°С - 42°С клетки E.coli гибнут.

На третьей стадии к смеси клеток с ДНК добавляют питательную среду без антибиотиков (LB или SOC) и растят при перемешивании при 37°С. На этой стадии происходит восстановление трансформированных клеток и их размножение. После этого суспензию клеток высевают на чашку с твердой питательной средой, содержащей необходимый антибиотик. Метод химической трансформации обычно используют, когда работают с плазмидами размером 2 – 10 kb.

В случае электропорации проникновение ДНК в бактериальную клетку происходит под действием электрического поля при высоком напряжении в течение краткого времени. Условия электропорации (напряженность поля и длительность импульса) могут требовать предварительной оптимизации. Подготовка клеток не требует обработки их ионами двухвалентных металлов, но необходимо несколько раз промыть их стерильным раствором 10% глицерина от солей, содержащихся в питательных средах, так как наличие даже их минимальных концентраций может резко увеличить проводимость при электропорации (опасно для жизни!!!!) и снизить общую эффективность трансформации. Электропорацию проводят в электропораторах в специальных кюветах. В кювете смешивают электрокомпетентные (отмытые от солей) клетки и ДНК, затем кювету помещают в электропоратор и проводят электропорацию. Затем к смеси клеток и ДНК добавляют питательную среду, доращивают клетки и высевают их на чашки, как в случае химической трансформации. Метод электропорации обычно используют, когда 1)работают с плазмидами с молекулярной массой выше 10 kb, 2) необходимо сделать котрансформацию двух (или даже трех!) плазмид, 3) при работе с библиотеками ДНК, требующих большого количества трансформаций.

В обоих случаях после получения свежего препарата компетентных/электрокомпетентных клеток необходимо провести их контрольную трансформацию известным количеством плазмиды для того, чтобы 1) проверить чистоту полученного препарата компетентных клеток, 2) примерно оценить их компетентность. Компетентность клеток можно определить, как количество колоний, которое вырастает на чашке после трансформации клеток 1 мкг ДНК.

Чтобы оценить компетентность полученного препарата, необходимо посчитать количество колоний, выросших на чашке после трансформации (если выросло много колоний, чашку удобно делить на сектора, считать число колоний в каждом секторе, а потом умножать полученное значение на число секторов), и зная количество ДНК, которое было взято на трансформацию, рассчитать компетентность клеток на 1 мкг ДНК. Компетентность клеток 10⁷ - 10⁸ может быть оценена, как высокая.

Приготовление компетентных клеток для химической трансформации (метод Mg ^2+/PEG)