Размножение E.coli в питательных средах и его факторы

Размножение E.coli в стандартных условиях может быть описано кривой, которая представляет собой зависимость количества клеток E.coli в суспензии от времени роста (см. рис в презентации). Количество клеток E.coli в суспензии эквивалентно оптической плотности культуры E.coli, измеренной при 600 нм («мутность суспензии»). Кривая размножения E.coli включает в себя 4 основные фазы: (начальная фаза, lag-phase), экспоненциальная фаза (exponential, log-phase), стационарная фаза (stationary phase) и фаза смерти (death phase). В процессе начальной фазы роста, увеличение клеточной биомассы происходит очень медленно. Это связано с исходно небольшим количеством клеток. Когда оптическая плотность суспензии достигает приблизительно значения 0.1, рост E. coli переходит в экспоненциальную фазу – фазу быстрого роста. Установлено, что во время экспоненциальной фазы оптическая плотность культуры увеличивается в среднем в два раза через каждые 30 минут. Когда оптическая плотность суспензии становится равной примерно 1.5, из-за большого количества клеток и небольшого количества питательных веществ в среде рост E.coli существенно замедляется и переходит в стационарную фазу. И, наконец, избыточно большое количество клеток в суспензии, практически полное истощение питательной среды и высокая концентрация в ней метаболитов бактерий приводит к гибели бактериальных клеток, их лизису и снижению плотности бактериальной культуры (фаза смерти).

Стандартными условиями роста E.coli в суспензии являются следующие параметры: питательная среда LB-broth, температура 37  C, интенсивное перемешивание (не менее 150 об/мин) и достаточная аэрация. Следует заметить, что рост E.coli возможен не только в суспензии, но и на так называемых твердых питательных средах, содержащих агар. В этом случае интенсивное перемешивание не требуется.

Питательные среды для роста E.coli.

Жидкие питательные среды. Как уже упоминалось выше, наиболее широко используемой средой для роста E.coli в суспензии является среда LB-broth (Luria Bertani medium, lysogeny broth). Эта высокопитательная среда и ее основными компонентами являются триптон или пептон, дрожжевой экстракт и NaCl. Триптон (пептон) являются продуктами гидролиза казеина под действием трипсина (пепсина) и служат источниками аминокислот и пептидов. Дрожжевой экстракт является источником углерода, витаминов (в том числе группы B), а также минеральных веществ, таких, как ионы магния, серы, кальция; а NaCl – обеспечивает бактериальные клетки ионами Na⁺ для реализации эффективного транспорта и поддержания осмотического баланса. Чтобы приготовить среду LB, необходимо растворить 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта и 10 г NaCl (или 25 г готовой смеси) в 1 л воды, проавтоклавировать и остудить. Следует заметить, что рост различных штаммов E.coli в среде LB происходит с различной скоростью и некоторые штаммы очень чувствительны к высокому содержанию NaCl. Известно, что NaCl в 10% концентрации может оказывать ингибирующее действие на рост некоторых штаммов E.coli. В связи с этим, были разработаны протоколы средне-солевой среды LB (5 г NaCl/л LB) и низкосолевой среды LB (0.5 г NaCl/л) при идентичном содержании пептона и дрожжевого экстракта. Низкосолевой вариант среды LB также используется в том случае, если в среду роста планируется добавлять антибиотик, чувствительный к высоким концентрациям соли. pH среды LB без дополнительного доведения равняется приблизительно 7.0 – 7.2.

В норме для достижения стационарной фазы растить E.coli следует 14-18 часов, однако, иногда возникают ситуации, когда требуется растить E.coli в течение нескольких суток (например, для наработки больших количеств биомассы при экспрессии белка). В таком случае, использование среды LB не эффективно, так как происходит истощение питательных веществ и понижение pH среды, вызванное высокой концентрацией метаболитов, что инициирует гибель клеток и ингибирует их рост. В таких случаях для роста E.coli используют другие среды, содержащие дополнительные питательные вещества и буферные системы для поддержания pH. Для увеличения питательных веществ большинство таких сред содержат двукратное или трехкратное количество триптона и дрожжевого экстракта. Кроме этого, в состав некоторых сред входят: глицерол или глюкоза в качестве дополнительных источников углерода (среды TB, SOC), фосфатная буферная система или СаСО₃, препятствующие закислению среды и поддерживающие ее pH в стационарной фазе роста E.coli (среда TB), а также соли Mg²⁺ и K⁺ (среды 2*YT, SOB, SOC).

Для роста E.coli в жидких питательных средах обычно используют предварительно стерилизованные или обработанные спиртом конические стеклянные колбы или 50 мл пластиковые пробирки Falcon. Наращивание биомассы E.coli для последующего выделения плазмидной ДНК обычно проводят в течение ночи, т. е. получают «ночную» культуру. Для этого в колбу или пластиковую пробирку со средой в присутствии необходимого антибиотика помещают небольшое количество предварительно трансформированных плазмидой бактерий и выращивают культуру при 37°С и 150 об/мин в течение 14 –18 часов. Готовая «ночная» культура представляет собой мутную суспензию клеток в среде. Для реализации некоторых задач (например, получения компетентных клеток или экспрессии рекомбинантных белков) требуется доращивать клетки до определенных значений OD600 (обычно 0.3 – 0.8). В таких случаях необходимо осуществлять мониторинг оптической плотности растущей культуры, чтобы не пропустить момент достижения нужной оптической плотности.

Твердые питательные среды. Твердая питательная среда используется в том случае, когда необходимо получить единичные колонии E.coli. Обычно это требуется, когда клетки трансформируют гетерогенной смесью плазмидных ДНК (например, в случае лигазной смеси) и необходимо найти колонию, содержащую правильный вариант плазмиды. Обычно в случае твердых питательных сред для роста E.coli используют одноразовые пластиковые чашки диаметром 90 мм. Наиболее распространенной твердой питательной средой является 1.5 % агар, приготовленный на LB (LB-агар). Для приготовления 1 л такой среды 15 г агара, 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта и 10 г NaCl (или 25 г готовой смеси LB) необходимо растворить в 1 л дистиллированной воды и проавтоклавировать. Агар следует остудить до температуры 50°C - 60°С, добавить в него необходимый антибиотик, разлить по чашкам приблизительно по 10 мл на чашку и оставить застывать под ламинаром рядом с горелкой, приоткрыв крышку. Когда конденсат испарится, чашку можно использовать для посева бактерий.

Температура. С понижением температуры рост E.coli замедляется, однако в некоторых случаях E.coli растят при более низких температурах в течение нескольких дней, как, например, при приготовлении из культуры E.coli компетентных клеток или при экспрессии рекомбинантных белков.

Перемешивание и аэрация. Для обеспечения достаточной аэрации растить E.coli в суспензии необходимо при интенсивном перемешивании (не менее 150 об/мин), а сосуд (колба или пластиковая пробирка) должны быть заполнены средой максимум на 1/10 от общего объема. Для улучшения аэрации крышки пробирок, используемые для роста бактериальной культуры закрывают неплотно, а для закрытия колб используют фольгу. В некоторых случаях используют колбы со специальными внутренними лопастями -«отбойниками». При перемешивании в таких колбах поверхность соприкосновения среды с воздухом заметно увеличивается благодаря разбрызгиванию жидкости. Чем больше отбойников в колбе, тем сильнее разбрызгивание жидкости и выше аэрация. В случае роста E.coli на твердой питательной среде аэрация происходит благодаря тому, что между стенками бактериальной чашки и крышкой предусмотрено некоторое пространство для проникновения воздуха.

Антибиотики Как уже упоминалось выше, большинство плазмид содержат ген устойчивости к антибиотику, в присутствие которого происходит отбор клеток, содержащих плазмиду от клеток, ее не содержащих. Наиболее широко используемыми для селекции антибиотиками являются ампициллин (рабочая концентрация – 100 мкг/мл), канамицин, (рабочая концентрация – 30 мкг/мл), и хлорамфеникол (рабочая концентрация – 25-30 мкг/мл). Антибиотики обычно растворяют в этаноле или в воде (для каждого антибиотика условия растворимости свои), готовят тысячекратные стоковые растворы и хранят при -20°C. Перед добавлением антибиотиков в LB-агар необходимо его остудить до 50-60°C, т.к антибиотики легко разрушаются при высоких температурах. Некоторые антибиотики, например, ампициллин, светочувствительны, поэтому рост бактерий в их присутствие желательно проводить в темноте.