Опыты по клонированию амфибий

ТЕМА № 8

РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ В ПРОЦЕССЕ РАЗВИТИЯ

Гилберт С. Т. 3. Гл. 10 (со с. 92), 11, 12, 13, 14

Корочкин Л.И. Гл. 2, 3, 9, 14

Клонирование амфибий. Тождество геномов. Генетический полиморфизм. Запрограммированные перестройки генома в онтогенезе. Дифференцировка лимфоцитов. Формирование генов легких и тяжелых цепей антител Дифференциальная экспрессия генов. Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции. Механизмы дифференциальной транскрипции генов. Регуляция экспрессии генов на уровне процессинга РНК.: дифференциальный процессинг РНК в иммунной системе, генерация новых белков в разных клетках в разное время (кальцитонин, фибронектин). Контроль на уровне трансляции при координированном синтезе белка: продукция гемоглобина. Посттрансляционная активация и инактивация белков (посттрансляционные модификации у коллагена).

ОПЫТЫ ПО КЛОНИРОВАНИЮ АМФИБИЙ

Генетика развития изучает проблему реализации наследственных потенций оплодотворенного яйца в течение жизни организма. Когда мы наблюдаем развитие зародыша, становится очевидным, что в клетках разных типов экспрессируются разные гены. Гемоглобин, например, характерен для эритроцитов, тогда как кристаллик обнаруживается только в клетках хрусталика глаза. Клетки сетчатки способны передавать электрические импульсы на большие расстояния, а прилежащие к ним клетки пигментного эпителия черны от гранул меланина и лишены способности проводить электричество.

Клетки каждого из типов образуются в результате многократных делений одного и того же оплодотворенного яйца. Возникает вопрос – что происходит далее с генетической информацией, меняется ли она в процессе развития, чем вызвана экспрессия разных генов в разных клетках – изменениями в структуре ДНК или другими механизмами.

Такие процессы как трансдетерминация и трансдифференцировка показывают, что даже дифференцированные клетки взрослого организма могут сохранять потенции к образованию клеток других типов.

Окончательно решить вопрос о том, является ли сужение функций ядра дифференцированной клетки необратимым, было бы можно, проверив способность этого ядра индуцировать образование дифференцированных клеток любого другого типа. Для этого следует имплантировать ядро какой-либо дифференцированной клетки в яйцо, собственное ядро которого предварительно было удалено. Если любое пересаженное ядро идентично ядру зиготы, то оно должно обеспечить полное развитие организма.

Опыты Бриггса и Кинга по пересадке ядер у леопардовой лягушки (Rana pipiens)

В 1952 г. Бриггс и Кинг показали, что ядра, взятые у зародыша на стадии бластулы, будучи перенесенными в цитоплазму яйцеклетки, обеспечивают развитие полностью сформированного головастика. Еще раньше Шпеман продемонстрировал, что клетки бластулы не детерминированы и, следовательно, их ядра тотипотентны. 60% всех имплантированных ядер оказались способными направлять развитие яиц до стадии свободно плавающего головастика; все эти головастики были диплоидными (результат, подтверждающий, что их ядра происходили из ядра клетки-донора).

Что произойдет, если в активированное энуклеированное яйцо пересадить ядро из клетки зародыша, находящегося на более продвинутой стадии развития? Оказалось, что большинство ядер из клеток бластулы способны обеспечить развитие яиц-реципиентов до стадии нормальных свободно плавающих головастиков, однако в ядрах, взятых от доноров, находящихся на более поздних стадиях развития, эта способность резко ограничивается. Ни одно из ядер соматических клеток, взятых на стадии хвостовой почки, не могло дать информацию, необходимую для развития нормального зародыша. Однако, когда на той же стадии брали ядра половых клеток (в норме дающих после оплодотворения начало целому организму), в 40% случаев были получены бластулы, способные к дальнейшему развитию. Следовательно, соматические клетки, становясь детерминированными и дифференцированными, по-видимому, утрачивают способность обеспечивать полное развитие организма.

Опыты Джона Гердона по пересадке ядер у шпорцевой лягушки (Xenopus laevis)

Джон Гёрдон и его коллеги, используя несколько измененную методику пересадки ядер, получили результаты, показывающие, что многие из ядер дифференцированных клеток остаются тотипотентными.

Главное различие между опытами Гёрдона и опытами Бриггса и Кинга заключалось в выборе объекта исследований. Гёрдон изолировал ядра из клеток Xenopus laevis, южноафриканской шпорцевой лягушки. Эта лягушка гораздо более примитивна, чем Rana pipiens; у нее отсутствуют веки, среднее ухо и даже язык, столь характерный для позднее эволюционировавших видов Rana. Шпорцевая лягушка отличается также и по биологии развития. В отличие от леопардовой лягушки взрослая особь Xenopus способна регенерировать утраченные конечности; раннее развитие у нее протекает в три раза быстрее, чем у леопардовой лягушки. В частности, для достижения стадии хвостовой почки зародышу Rana pipiens требуется 80 ч, тогда как Xenopus laevis достигает той же стадии развития всего за 26 ч. Следовательно, ядра энтодермальных клеток на стадии хвостовой почки у шпорцевой лягушки имеют такой же возраст, как ядра из клеток ранней гаструлы у Rana.

Гёрдон также обнаружил постепенную утрату потенций ядер по мере развития. Однако из этого правила выявились интересные исключения. Гёрдон переносил ядра из энтодермальных эпителиальных клеток кишечника, взятые у головастика Xenopus на стадии перехода к активному питанию, в активированные энуклеированные яйца. Ядра клеток донора имели генетический маркер-одно ядрышко на клетку (линия 1-пи) вместо обычных двух (линия 2-пи). Из 726 пересаженных ядер только 10 оказались способными обеспечить развитие зиготы до стадии донора. В некоторых случаях ядра были способны реализовать информацию, достаточную для достижения стадии головастика и образования клеток всех линий-нейронов, клеток крови и др. Кроме того, семь головастиков (развившихся после пересадки в яйца ядер, полученных клонированием двух исходных ядер) метаморфизировали и превратились в половозрелых взрослых лягушек (1966). Эти ядра были тотипотентными. Кроме того, Гёрдон и его коллеги провели следующие опыты. Они культивировали эпителиальные клетки из кожных межпальцевых перепонок ноги взрослой особи Хеnopus. Эти клетки были, безусловно, дифференцированными, потому что каждая из них содержала кератин-белок, характерный для клеток кожи взрослых особей. Когда ядра этих клеток пересаживали в энуклеированные яйца, ни одно из ядер не обеспечивало развития зародышей дальше нейрулы. Однако после клонирования ядер и их пересадки в энуклеированные яйца из таких яиц развивались многочисленные головастики; правда, все они погибали, не переходя на активное питание (1975). Сходную остановку развития наблюдали другие исследователи, пытаясь получить взрослых лягушек при пересадке ядер лимфоцитов.

Результаты опытов по клонированию ядер у амфибий позволяют сделать два вывода. 1) Во-первых, в них можно увидеть общее правило ограничения потенций в процессе развития. Это ограничение генетически детерминировано и характерно для ядер определенного типа клеток-доноров. 2) Во-вторых, можно легко убедиться в том, что геном дифференцированной клетки обладает изумительной способностью инициировать образование всех типов клеток головастика.