Иммобилизация мицелия гриба в стационарном состоянии

Иммобилизацию мицелия гриба осуществляли также в стационарном состоянии. При этом в качестве носителей использовали:

ü дубовые опилки,

ü костру льна,

ü сосновые стружки.

Иммобилизацию продуцента осуществляли в колбах Эрленмейера объемом 750 мл. В боксе в стерильных условиях в зоне пламени горелки в колбы вносили 10 мл питательной среды, 20 мл посевного материала (III пассаж, 3 суток роста) и носители в количестве 100 см³, что составляло для дубовых опилок – 4 г, костры льна – 4 г, сосновые стружки – 6 г (удельная площадь поверхности составила 96, 8 см²/г). Активность посевного материала составила 6, 65 Е_ОА.

Питательная среда имела следующий состав: мука пшеничная – 29, 0 г/л; кукурузный экстракт – 6, 4 г/л; NH₄NO₃ – 2, 0 г/л; КН₂РО₄ – 1, 3 г/л; вода водопроводная – до 1 л. Для стимулирования продуцирования лакказы в среду был добавлен CuSO₄ в концентрации 0, 05г/л. pH среды до стерилизации – 5, 6-5, 8. Затем колбы инкубировали в термостате при температуре 32 º С в течение 10 суток. Опыт осуществляли в трех повторностях.

В результате проведения экспериментов по иммобилизации на дубовых опилках и костре льна был установлен поверхностный рост культуры, который выражался сначала в появлении четко различимых отдельных белых пеллет гриба, а затем в полном обрастании поверхности носителя белым воздушным мицелием. При этом носитель слежался в плотный комок (рис. 5).

а) б)

Рисунок – 5. Иммобилизация мицелия грибной культуры на а) костре льна, б) дубовых опилках

В колбах с сосновыми стружками было отмечено постепенное обрастание носителя. Носитель не слеживался и не слипался, что, в свою очередь, обеспечило свободный доступ воздуха к иммобилизованному мицелию и способствовало более интенсивному проникновению мицелия вглубь структуры носителя (рис. 6).

Рисунок – 6. Иммобилизация мицелия грибной культуры на сосновых стружках

Таким образом, на основании проведенных исследований был сделан вывод о том, что наиболее перспективным носителем для иммобилизации мицелия штамма-деструктора являются древесные стружки, в том числе хвойных пород, которые обеспечивают воздухопроницаемую структуру, необходимую для закрепления мицелия. В качестве способа иммобилизации наиболее пригодным следует считать внесение жидкого посевного материала в стационарную твердофазную культуру.

4.3 Изучение динамики оксидазной активности в культуральной жидкости Trametes hirsuta 56, иммобилизованного на различных носителях

Изучение динамики оксидазной активности в культуральной жидкости Trametes hirsuta 56 осуществляли при использовании в качестве носителей стальных губок и растительной губки люфы.

Иммобилизацию продуцента осуществляли в колбах Эрленмейера объемом 750мл на круговой качалке. В боксе в стерильных условиях в зоне пламени горелки в колбы вносили 150 мл питательной среды, 0, 5% по объему посевного материала (II пассаж, 3 суток роста) и носители в количестве 50 см³, что составило для стальных губок – 6 г, люфы – 3 г. В контрольные колбы вносили 150 мл питательной среды и 0, 5% по объему посевного материала (II пассаж, 3 суток роста). Активность посевного материала составила 6, 2 Е_ОА.

Питательная среда имела следующий состав: мука пшеничная – 29, 0 г/л; кукурузный экстракт – 6, 4 г/л; NH₄NO₃ – 2, 0 г/л; КН₂РО₄ – 1, 3 г/л; вода водопроводная – до 1 л. Для стимулирования продуцирования лакказы в среду был добавлен CuSO₄ в концентрации 0, 05г/л. pH среды до стерилизации – 5, 6-5, 8. Затем колбы инкубировали на круговой качалке с частотой вращения 200 об/мин при температуре 32 º С в течение 10 суток. Опыт осуществляли в трех повторностях.

В результате проведения экспериментов было установлено, что максимальная активность лакказы при иммобилизации гриба на стальных губках была отмечена на 7 сутки эксперимента (3, 5 Е_ОА) (рис.7). Максимум активности лакказы при иммобилизации продуцента на растительной губке люфе пришелся на 5 сутки эксперимента (1, 4 Е_ОА).

Рисунок – 7. Динамика оксидазной активности в культуральной жидкости Trametes hirsuta 56, иммобилизованного на различных носителях

Также было установлено, что продуктивность по лакказе культуры продуцента, иммобилизованной на различных носителях, превышает продуктивность по лакказе неиммобилизованной глубинной культуры. Так, продуктивность на стальных губках составляла 0, 5 Е_ОА/ сут. (3, 5 Е_ОА на 7 сутки), тогда как продуктивность неиммобилизованной культуры 0, 2 Е_ОА/ сут. (0, 9 Е_ОА на 5 сутки). Продуктивность на люфе составила 0, 3 Е_ОА/ сут. (1, 6 Е_ОА на 5 сутки).

4.4 Изучение динамики оксидазной активности культуральной жидкости базидиального гриба Trametes hirsuta 56, иммобилизованного с использованием различных способов засева носителя

Изучение динамики оксидазной активности культуральной жидкости грибной культуры Trametes hirsuta 56 осуществляли при использовании двух вариантов засева носителя: глубинной культурой по методу Iqbal c соавторами [Iqbal M. et al., 2005 ] и поверхностной культурой (агаровыми блоками) по методу Rodrí guez Couto c соавторами [Rodrí guez Couto S. et al., 2004]. В качестве носителя в данном эксперименте использовали стальные губки.

Губки из нержавеющей стали были порезаны на кусочки диаметром приблизительно 1, 5 см. Перед использованием носитель был подвержен кипячению в течение 10 мин, а затем трижды промыт дистиллированной водой.

Носитель был подвержен стерилизации в автоклаве при температуре 121 º С в течение 40 мин.

Иммобилизацию продуцента осуществляли в колбах Эрленмейера объемом 750мл на круговой качалке. В боксе в стерильных условиях в зоне пламени горелки в колбы вносили 150 мл питательной среды, 0, 5% по объему посевного материала (III пассаж, 3 суток роста) с концентрацией воздушно-сухой биомассы 15г/л и влажностью 8% и носитель в количестве 50 см³, что составляло для стальных губок – 6 г. Активность посевного материала составила 6, 2 Е_ОА.

Засев носителя поверхностной культурой (агаровыми блоками) также осуществляли в боксе в стерильных условиях в зоне пламени горелки путем внесения в колбы 150 мл питательной среды, 3 агаровых блока площадью 0, 5 см² каждый с мицелием гриба (7 суток роста), с концентрацией абсолютно-сухой биомассы 0, 0025 г/см², и носитель в количестве 50 см³, что составляло для стальных губок – 6 г.

Питательная среда имела следующий состав: мука пшеничная – 29, 0 г/л; кукурузный экстракт – 6, 4 г/л; NH₄NO₃ – 2, 0 г/л; КН₂РО₄ – 1, 3 г/л; вода водопроводная – до 1 л. Для стимулирования продуцирования лакказы в среду был добавлен CuSO₄ в концентрации 0, 05г/л. pH среды до стерилизации – 5, 6-5, 8. Затем колбы инкубировали на круговой качалке с частотой вращения 200 об/мин при температуре 32º С в течение 10 суток. Опыт осуществляли в трех повторностях. Результаты эксперимента приведены на рисунке 8.

Рисунок – 8. Динамика оксидазной активности культуральной жидкости базидиального гриба Trametes hirsuta 56, иммобилизованного различными вариантами засева носителя

В результате проведения экспериментов было установлено, что активность лакказы грибной культуры, иммобилизованной на стальных губках, достигает максимального значения на 7 сутки эксперимента (рисунок 8). При этом активность лакказы при засеве носителя глубинной культурой (3, 5 Е_ОА) значительно превышала активность лакказы при засеве носителя поверхностной культурой (2, 2 Е_ОА).

Сравнение двух использованных методик показало, что при иммобилизации глубинной культуры по методу Iqbal c соавторами [Iqbal M. et al., 2005] в колбу вносили 0, 01г абсолютно сухого мицелия, а при иммобилизации поверхностной культуры по методу Rodrí guez Couto c соавторами [Rodrí guez Couto S. et al., 2004] в колбу вносили 0, 0038 г абсолютно сухого мицелия. Возможно, что при выравнивании количества вносимого мицелия при засеве глубинной культурой и поверхностной культурой, последняя будет не менее эффективна.