Условия культивирования штамма-продуцента

Глава 3. Материалы и методы, используемые в работе. Характеристики биологического объекта

Характеристика штамма-продуцента лакказы

В работе использовали чистую культуру гриба Trametes hirsutа 56 (Wulfen) Pilаt. – продуцента лакказы.

Культура хранилась на скошенном агаризованном сусле в пробирках при температуре +4⁰ С с периодическими пересевами через каждые 6 месяцев.

Trametes hirsuta 56характеризуется высокой скоростью роста и активным синтезом экстрацеллюлярных фенолоксидаз в условиях жидкофазного глубинного культивирования. Основным ферментом фенолоксидазного комплекса является лакказа.

На твердом агаризованном сусле образует колонии с хорошо развитым шерстисто-волокнистым воздушным мицелием белого цвета. На агаризованом сусле на 3-и сутки выращивания при температуре 26^оС диаметр колонии достигает 6-7 см. Край колонии гладкий, прижатый. Реверзум неизмененный, затем побелевший. При старении колонии с желтоватым или кремоватым оттенком, образуют зачатки плодовых тел в виде бугорков 3-10 мм в диаметре, или плодовые тела в виде дисков с приподнятыми краями, часто сливающимися, с неясной зональностью, белых, со временем желтеющих. Запах приятный грибной.

В глубинной культуре мицелиальные агломераты сферической или неправильной формы. В центральной части глобул гифы утолщены, искривлены, в крупных глобулах на срезе наблюдается зональность, могут быть полости. В зависимости от условий глобулы могут быть гладкие или опушенные. Диаметр глобул от 8 до 1 мм.

В глубинной и поверхностной культуре образует кристаллы кубической, призматической или игольчатой формы. Образует хламидоспоры, артроспоры и оидии. Гифы разветвляются под прямым углом, перегородки долипоровые. Гифы могут образовывать вздутия и утолщения на концах. Гифы трех типов, в глубинной культуре преимущественно двух типов: тонкие (0, 8-1, 6 мкм) и толстые (2-4 мкм). Пряжки одиночные, большие, крутоизогнутые, без просвета.

Оптимальная температура выращивания (31±1) ^оС, оптимальное значение рН 4, 0.

Условия культивирования штамма-продуцента

Trametes hirsutа культивировалина питательной среде следующего состава:

· Мука пшеничная – 29, 0 г/л;

· Аммоний азотнокислый – 2, 0 г/л;

· Калий фосфорнокислый однозамещенный – 1, 3 г/л;

· Кукурузный экстракт сгущенный – 6, 4 г/л;

· CuSO₄ – 0, 05 г/л;

· Вода водопроводная – до 1 л.

· рН до стерилизации 5, 65-5, 85

Все компоненты последовательно растворяют в воде и доводят рН до 5, 65-5, 85 путем титрования 10% серной кислотой или 10% гидроокисью натрия. Приготовленную среду разливают по 150 мл в колбы Эрленмейера вместимостью 750 мл и закрывают ватными пробками и стерилизуют при давлении 0, 18 МПа в течение 40 мин. И охлаждают до t = 30-32 ^оС.

pH среды измеряли потенциометрически.

Культивирование проводили в колбах на круговой качалке при 200 об·мин^-1 и температуре (30-32)°С. Первый пассаж засевали кусочками агара с мицелием, выраженного на косяке с агаризованным суслом, второй и последующие глубинной культурой в количестве 10 % от объема питательной среды. Продолжительность культивирования для первого пассажа составляла 4 суток для последующих – 3 суток.

Контроль морфолого-физиологического состояния и чистоты культуры проводили микроскопически с использованием светового микроскопа Olympus BX41 с объективами 20х, 40х и 100х.