Выполнение анализа и обработка результатов

От каждой серии свежеприготовленной воды дистиллированной отбирают среднюю пробу в объёме не менее 50 см³.

Испытание проводят двухслойным агаровым методом в чашках Петри d (90-100) мм. Посевы просматривают ежедневно.

Определение общего числа бактерий.

Воду дистиллированную вносят по 1 см³ в каждую из двух пробирок с 4 см³ расплавленной и охлажденной до температуры (45-50) ^оС среды № 1. Быстро перемешивают и переносят в чашку Петри, содержащую (15-20) см³ застывшей среды

№ 1. Быстрым покачиванием чашки Петри равномерно распределяют верхний слой агара. После застывания среды чашки переворачивают и инкубируют в течение 5 суток при температуре (30-35) ^оС.

Через 48 ч и окончательно через 5 суток подсчитывают число бактериальных колоний на 2-х чашках, находят среднее значение и, умножая его на показатель разведения, вычисляют число бактерий в 1 см³ воды. Для получения достоверных результатов учитывают только те чашки, на которых выросло от 30 до 300 колоний. Если число колоний на чашке более 300, делают ряд разведений фосфатным буферным раствором (1: 10, 1: 100 и т.д.), выбирая для посева разведение, наиболее соответствующее указанному выше уровню.

Определение общего числа грибов.

Испытание проводят двухслойным агаровым методом, как изложено выше, используя среду № 2. Посевы инкубируют в течение 5 суток при температуре (20–25) ^оС.

Через 72 ч и окончательно через 5 суток подсчитывают общее число колоний дрожжевых и плесневых грибов на 2-х чашках, находят среднее значение и, умножая его на показатель разведения, вычисляют число грибов в 1 см³ воды. На чашке учитывают все колонии грибов, даже если их число менее 30.

Выявление и идентификация бактерий семейства Enterobacteriaceae.

Испытуемый образец (10 см³) вносят в 100 см³ питательной среды № 3, перемешивают и инкубируют при температуре от 30 до 35 ^оС в течение (24-48) ч. При наличии роста делают пересев петлей на среды №№ 4, 5, разлитые в чашки Петри. Посевы инкубируют при температуре от 30 до 35 ^оС в течение (24-48) ч. Если после инкубации на средах № 4 и № 5 нет роста, значит в образце отсутствуют бактерии семейства Enterobacteriaceae.

Колонии, подозрительные по морфологии на принадлежность к семейству Enterobacteriaceae, пересевают каждую отдельно со сред №№ 4, 5 на скошенную в пробирках среду № 1 и выращивают при температуре от 30 до 35 ⁰С в течение (18-20) ч. Из каждой пробирки с чистой культурой через сутки делают пересевы на среды № 6 (для определения ферментации глюкозы) и №7 (для определения восстановления нитратов в нитриты).

После посева в половину пробирок со средой № 6 вносят по 0, 5 см³ стерильного вазелинового масла. Все посевы инкубируют при температуре от 30 до 35 ⁰С в течение (18-20) ч. К суточной исследуемой культуре бактерий на среде № 7 добавляют (0, 2-0, 3) см³ реактива Грисса, погружая пипетку до дна пробирки.

Параллельно исследуют чистые культуры на наличие фермента цитохромоксидазы, для этого полоску фильтровальной бумаги смачивают реактивом на цитохромоксидазу и наносят стеклянной палочкой суточную культуру исследуемых бактерий со скошенной среды № 1.

Ферментацию глюкозы устанавливают по изменению цвета среды № 6 из красного в желтый в пробирках с маслом и без него. О наличии нитритов в среде № 7 судят по появлению красного окрашивания при внесении в среду реактива Грисса. Появление синего окрашивания фильтровальной бумаги, смоченной реактивом на цитохромоксидазу, через (2-5) минут, свидетельствует о положительной оксидазной реакции.

Если в образце обнаружены грамотрицательные неспорообразующие палочки, которые дают отрицательную оксидазную реакцию, ферментируют глюкозу с образованием кислоты (или кислоты и газа) и восстанавливают нитраты в нитриты, значит вода контаминирована бактериями семейства Enterobacteriaceae.

Морфологические и тинкториальные свойства Enterobacteriaceae представлены в таблице 1.

Выявление и идентификация Pseudomonas аeruginosa и Staphilococcus aureus.

Воду дистиллированную в количестве 10 см³ вносят в 100 см³ питательной среды № 8, перемешивают и инкубируют при температуре от 30 до 35 ^оС в течение (24-48) ч. При наличии роста делают пересев петлей на среды №№ 9, 10 в чашках Петри. Посевы инкубируют при температуре (30-35) ^оС в течение (24-48) ч. Если после инкубации на средах №№ 9, 10 не обнаружены колонии микроорганизмов, значит в сырье нет искомых микроорганизмов.

При наличии на среде № 9 характерных для Pseudomonas аeruginosa колоний грамотрицательных неспорообразующих палочек, обладающих специфическим запахом и выделяющих сине-зеленый пигмент пиоционин в питательный агар, культуру исследуют на наличие фермента цитохромоксидазы. Для этого полоску фильтровальной бумаги смачивают реактивом на цитохромоксидазу и наносят стеклянной палочкой суточную культуру исследуемых бактерий со среды № 9.

Если в образце обнаружены грамотрицательные неспоробразующие палочки, которые дают положительную оксидазную реакцию (синее окрашивание полоски фильтровальной бумаги) и образуют сине-зеленый пигмент, значит вода контаминирована Pseudomonas аeruginosa.

Наличие на среде №10 золотисто-желтых колоний грампложительных кокков, окруженных желтыми зонами, свидетельствует о ферментации маннита. Чистую культуру Staphilococcus aureus исследуют на наличие фермента плазмокоагулазы. Для этого кровь, взятую стерильным шприцем из сердца кролика, помещают в 5 % стерильный раствор натрия цитрата, отсасывают плазму, разводят 1: 5 0, 9 % стерильным раствором натрия хлорида и разливают по 0, 5 см³ в стерильные пробирки. В каждую пробирку помещают 1 петлю суточной культуры Staphilococcus aureus и инкубируют при температуре от 30 до 35 ^оС в течение (4-6) ч. Если в течение этого времени не наблюдается свертывания плазмы, реакцию плазмокоагуляции считают отрицательной.

Обязательно наличие 2-х контролей:

контроль раствора плазмы;

контроль культуры Staphilococcus aureus, обладающей коагулазной активностью.

Для удобства постановки реакции можно использовать сухую кроличью цитратную плазму промышленного производства, которую разводят согласно инструкции по применению.

Если в образце обнаружены грамположительные кокки, которые ферментируют маннит и дают положительную реакцию плазмокоагуляции, значит вода контаминирована Staphilococcus aureus.

Морфологические и тинкториальные свойства Pseudomonas аeruginosa, выращенных на средах № 9 и 10 представлены в таблице 2.

При выявлении в результате анализа в 1 см³ воды дистиллированной более 100 микроорганизмов и (или) при наличии бактерий семейства Enterobacteriacеae и Staphilococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa партию воды считают не прошедшей испытание.