Приготовление мясо-пептонного бульона (МПБ)

Первый этап- получение мясной воды. Мясо, очищенное от жира и от сухожилий, пропускают через мясорубку, заливают двойным количеством холодной водопроводной воды и настаивают в течение суток в прохладном месте. Затем мясной настой вместе с мясом кипятят в течение 1 часа, после чего остужают, фильтруют, доливают водопроводной водой до первоначального объема, разливают по бутылям и стерилизуют при давлении 1атм. 30 минут.

Мясная вода содержит минеральные вещества, углеводы, витамины.

Второй этап- к мясной воде прибавляют 1% сухого пептона и 0, 5% хлорида натрия, кипятят, устанавливают рH 20 % раствором едкого натра.

Приготовление мясо — пептонного агара (МПА)

К мясо — пептоному бульону добавляют 2% морской водоросли агар-агара, который плавится при 100°С и затвердевает при комнатной температуре. После стерилизации в автоклаве мясо — пептонный агар, разлитый в пробирки, оставляют застыть столбиком или готовят скошенный агар, укладывая пробирки в наклонном положении под углом 20°С.

Питательные среды должны отвечать следующим требованиям:

1. питательность - среды должны содержать доступные источники азота, углерода и энергии;

2. изотоничность - они должны содержать набор солей для поддержания осмотического давления;

3. оптимальный показатель рН (для большинства бактерий 7, 2-7, 6);

4. оптимальный окислительно-восстановительный (редокс) потенциал - высокий для аэробов, низкий для анаэробов;

5. прозрачность, чтобы был виден рост бактерий;

6. стерильность, чтобы не было других бактерий.

28. Классификация сред.

По происхождению среды подразделяют на естественные (природные), искусственные и синтетические.

-Естественные среды могут содержать компоненты животного (например, кровь, сыворотка, желчь) или растительного (например, кусочки овощей и фруктов) происхождения.

-Искусственные среды изготовлены по определённым рецептам из различных настоев или отваров животного или растительного происхождения с добавлением неорганических солей, углеводов и азотистых веществ.

-Синтетические среды – содержат определённые химические соединения в точно указанных концентрациях.

По концентрации среды бывают жидкие, полужидкие, плотные, сыпучие, сухие.

По назначению среды подразделяют на основные (простые: 1%-ная пептонная вода, мясопептонный бульон/агар, бульон/агар Хоттингера и сложные: сахарный бульон/агар, сывороточный бульон/агар, кровяной агар, желчный бульон, желточно-солевой агар); специальные (обогащенные, среды для хранения), элективные, дифференциально-диагностические, консервирующие, транспортные, накопительные.

-основные (МПА, МПБ) – простые по составу и применяются для культивирования большинства неприхотливых бактерий;

-обогащенные – на основе простых + кровь, сыворотка, асцитическая жидкость и др. Используют для накопления определенной группы бактерий за счет создания условий, оптимальных для одних видов и неблагоприятных для других. Наиболее часто в качестве подобных агентов используют различные красители и химические вещества – соли желчных кислот, тетратионат Na⁺, теллурит K⁺; антибиотики, фуксин, генциановый фиолетовый, бриллиантовый зеленый и др.

-дифференциально-диагностические - позволяют различить бактерии по их росту, биохимической активности и другим признакам. В состав этих сред, кроме питательных веществ, обычно включают субстрат, по отношению к которому дифференцируются бактерии, и индикатор. Если микроб ферментирует субстрат, входящий в состав среды, то сдвигается рН среды, и в результате колонии окрашиваются в цвет индикатора;

-элективные - используют для избирательного культивирования микроорганизмов определенных видов при подавлении роста других микроорганизмов за счет добавления в среду различных ингибиторов роста микробов, изменения показателя рН, состава питательных веществ в среде и др.

-среды накопления - на которых одни виды размножаются быстрее других;

-транспортные и консервирующие среды предупреждают отмирание патогенов и подавляют рост сапрофитов, их применяют для временного сохранения микроорганизмов после взятия исследуемого материала.

29. 1) лаг-фаза (англ. lag — запаздывание) — период между посевом бактерий и началом их размножения, продолжительностью 4-5 часов;

Z) фаза логарифмического (экспоненциального) роста — период интенсивного деления бактерий, продолжительностью 5-6 часов;

3) фаза стационарного роста, при которой количество жизнеспособных клеток не изменяется, составляя максимальный уровень (М-концентрация);

4) фаза гибели бактерий.

30. Для получения изолированных колоний на практике наиболее часто используют модифицированный метод по Дригальскому (или метод «механического» разобщения). Для этого материал наносят частыми штрихами на поверхность плотной питательной среды в верхней трети чашки. Затем, отступив от основного посева, продолжают посев параллельными частыми штрихами на оставшейся поверхности среды. Подобный метод позволяет получить изолированные колонии и изучать их.

Указанные методы пригодны для посева аэробных и факультативно анаэробных бактерий, а также нестрогих анаэробов.

-Биологический метод получения чистых культур бактерий. Исследуемым материалом заражают лабораторное животное, чувствительное к какому-то одному микроорганизму, содержащемуся в патологическом материале. У животного возникает инфекционный процесс с накоплением возбудителя во внутренних органах, из которых и выделяют чистую культуру.

-Культуральный метод получения чистых культур бактерий. Используется только для бактерий рода Proteus, обладающих «ползучим» характером роста из-за наличия большого количества жгутиков. Исследуемый материал засевают в конденсационную воду у основания скошенного МПА. Протей «выползает» на скошенную часть среды, в то время как остальные бактерии растут на месте посева.

-Физический метод получения чистых культур бактерий. Используется для получения чистых культур спорообразующих бактерий. Исследуемый патологический материал подвергают кипячению в течение 5 минут для уничтожения не образующих спор ассоциантов, после чего засевают материал на питательные среды.

-Химический метод получения чистых культур бактерий. Используется для получения чистых культур кислотоустойчивых микроорганизмов, главным образом, микобактерий. Исследуемый патологический материал обрабатывают 5%-м раствором серной кислоты, под действием которого погибают некислотоустойчивые ассоцианты. После нейтрализации кислоты материал засевают на питательные среды

-Метод механического разобщения для получения чистых культур бактерий.

а) Рассев шпателем по Дригальскому. Берут 3 чашки Петри с питательной средой. На 1-ю чашку петлей или пипеткой наносят каплю исследуемого материала и растирают шпателем по всей поверхности питательного агара. Затем шпатель переносят во 2-ю чашку и втирают оставшуюся на шпателе культуру в поверхность питательной среды. Далее шпатель переносят в 3-ю чашку и аналогичным образом производят посев. На 1-й чашке вырастает максимальное количество колоний, на 3-й – минимальное. В зависимости от содержания микробных клеток в исследуемом материале на одной из чашек вырастают отдельные колонии, пригодные для выделения чистой культуры микроорганизма.

б) Рассев петлей (посев штрихами). Метод принципиально не отличается от предыдущего, но более экономичен. Берут одну (!!!) чашку Петри с питательным агаром и делят ее на 4 сектора, проводя разграничительные линии на внешней стороне дна чашки.

31. Анаэробы. Посевы анаэробных бактерий в жидких средах заливают вазелиновым или другим маслом. При использовании плотных сред посевы культивируют в специальных устройствах — анаэростатах (откуда откачивают воздух) либо заливают посевы тонким слоем агара. Анаэробные условия можно создать химическим путём, поместив посевы в эксикаторы, на дно которых заливают щелочной раствор пирогаллола, поглощающего кислород. Также можно использовать методы Фортнера, Цейсслера и Вёйнберга.

Метод Фортнера. Посевы проводят на чашку Петри с толстым слоем среды, разделённым пополам узкой канавкой, вырезанной в агаре. На одну половину засевают культуру аэробных бактерий, на другую — анаэробных. Края чашки заливают парафином и инкубируют в термостате. Первоначально наблюдают рост аэробов, а затем (после поглощения кислорода) — рост анаэробов.

Метод Цейсслера используют для выделения чистых культур спорообразующих анаэробов. Для этого проводят посев на среду Китта-Тароцци, прогревают 15 мин при 80°С (для уничтожения вегетативных форм), заливают вазелиновым маслом и инкубируют 24 ч. Затем проводят посев на сахарно-кровяной агар для получения чистых культур. После 24-часового культивирования подозрительные колонии изучают и отсевают на среду Китта-Тароцци (с последующим контролем чистоты выделенной культуры).

Метод Вёйнберга используют для получения чистых культур строгих анаэробов. Культуры, выращенные на среде Китта-Тароцци, вносят в сахарный бульон. Затем пастеровской пипеткой с запаянным концом материал переносят в узкие пробирки (трубки Виньяля) с сахарным МПА, погружая пастерку до дна пробирки. Засеянные пробирки быстро охлаждают холодной водой, что позволяет зафиксировать отдельные бактериальные клетки в толще затвердевшего агара. Пробирки инкубируют, и изучают выросшие колонии. При обнаружении подозрительной колонии на её месте делают распил, колонию быстро отбирают и засевают на среду Китта-Тароцци (с последующим контролем чистоты выделенной культуры).

32. На первом этапе для получения изолированных колоний делают посев исследуемого материала, как правило, на плотные питательные среды, выбор к-рых обусловливается свойствами предполагаемого возбудителя. Применяют по возможности элективные среды, на к-рых растет только данный вид бактерий, или дифференциально-диагностические среды, позволяющие отличить предполагаемого возбудителя от других микроорганизмов.

На втором этапе проводят исследование колоний бактерий, происходящих от одной бактериальной клетки и выросших на плотной питательной среде (колония и является чистой культурой возбудителя).

Третий этап заключается в идентификации выделенной чистой культуры возбудителя и определении его чувствительности к антибиотикам и другим химиотерапевтическим препаратам. Идентификацию выделенной бактериальной культуры осуществляют по морфологическим, тинкториальным, культуральным, биохимическим, антигенным, токсигенным свойствам.

33. Культуральные свойства бактерий - питательные потребности, условия роста и характер роста бактерий на бактериол. средах. В питательные потребности включают источники углерода, азота и ростовых факторов, способность бактерий расти на определенных питательных средах, в условия роста - рН, Eh, концентрацию О2 плотность, осмотическое давление среды, температуру роста; в характер роста - скорость роста (быстрый, медленный), внешний вид к-ры на жидких, плотных и полужидких средах, изменения, к-рые наступают в среде или отдельных ее компонентах в процессе роста микробов. Сведения о К.с. используют при выборе способов культивирования и при идентификации выделенной к-ры.