Лабораторная диагностика микоплазмозов, риккетсиозов и хламидиозов. Биопрепараты

Цель занятия. Ознакомить студентов со свойствами возбудите­лей, методами лабораторной диагностики микоплазмозов, риккетсиозов, хламидиозов, а также биопрепаратами.

Оборудование и материалы. Культуры микоплазм на жидких и плотных питательных средах, готовые фиксированные препара­ты риккетсий (вакцинный штамм), хламидий, красители для окраски по Стемпу, биопрепараты.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Контагиозная перипневмония крупного рогатого скота (поваль­ное воспаление легких). Инфекционная болезнь, протекающая в виде крупозной пневмонии и плеврита с последующим развити­ем анемических некрозов в легких.

Возбудитель контагиозной перипневмонии крупного рогатого скота — М. mycoides subsp. mycoides, род Mycoplasma, семейство Mycoplasmataceae.

Лабораторная диагностика перипневмонии крупного рогатого скота основана на результатах бактериологического и серологи­ческого исследований.

Бактериологическое исследование вклю­чает в себя обнаружение возбудителя в исходном материале ме­тодом световой микроскопии и биопробы, выделение чистой культуры посевом на питательные среды и идентификацию воз­будителя по культурально-морфологическим, ферментативным, серологическим и патогенным свойствам.

Материал для исследования. Для прижизненной диагностики ис­пользуют бронхиальную слизь, секрет молочной железы, мочу, а для посмертной (от животных, убитых с диагностической целью — в начале болезни или не позднее 2...3 ч после гибели) — асептично полученный плевральный экссудат, медиастинальные, бронхиаль­ные лимфоузлы, пораженные участки легких. Материал помеща­ют в стерильную посуду и пересылают в лабораторию нарочным в термосе со льдом или в замороженном виде.

Микроскопия препаратов из исходного материала. Для мико­плазм характерен выраженный полиморфизм, что обусловлено отсутствием ригидной клеточной стенки. Средние размеры микоплазм 0, 1...0, 2 мкм. В ранней экспоненциальной стадии роста форма клеток сферическая или овальная, позднее клетки удли­няются вплоть до нитей (рис. 112). Из исследуемого материала готовят мазки, окрашивают по методу Романовского—Гимзы или Грама. Краску Романовского—Гимзы разводят дистиллирован­ной водой в соотношении 1: 10 и препараты окрашивают в течение 24 ч при комнатной температуре. Клетки микоплазм обнару­живают в форме кокков, дисков, гроздевидных скоплений, тон­ких разветвленных нитей.

Выделение и идентификация культуры возбудителя. Для получе­ния культуры возбудителя исследуемый материал высевают на плотные и жидкие питательные среды. Микоплазмы прихотливы к условиям культивирования, поэтому в питательные среды до­бавляют дрожжевой экстракт, сыворотку крови, витамины, угле­воды. Наиболее часто используют жидкую и плотную среды Мар­тена, представляющие собой кислотный гидролизат фарша из свежих свиных желудков. Нередко применяют среду Эдварда, со­стоящую из отвара сердечной мышцы, воды, пептона, после стерилизации добавляют 20 % инактивированной сыворотки крови лошади или крупного рогатого скота и 10 % дрожжевого экстракта. В питательные среды для первичной изоляции добав­ляют ингибиторы, тормозящие рост сопутствующей бактериаль­ной микрофлоры: пенициллин, подавляющий рост грамположительных бактерий, но не действующий на микоплазмы; ацетат таллия, ингибирующий грамотрицательные бактерии. Посевы инкубируют при 37...38 °С.

Рис. 112. Микроструктура разных видов микоплазм (х1350):

а — шаровидные тела различных размеров и разной оптической плотности;

б— гигантские вакуолизированные тела;

в — мелкие сферические формы М. hominisw не имеющие определенной формы тела;

г — зернистые формы;

д — ветвистые нитевидные формы и стрептококкоподобные формы

В жидких питательных средах рост возбудителя в виде опалесценции различной интенсивности появляется на 2...3-й сутки. На плотных средах возбудитель формирует круглые с ровными краями колонии, напоминающие яичницу-глазунью, центр коло­нии в виде сосочка оптически более плотный, врастает в толщу среды (рис.113). На кровяном агаре колонии окружены зоной альфа-гемолиза.

У выделенных культур изучают ферментативные свойства. Возбудитель ферментирует глюкозу, мальтозу, маннозу, галакто­зу, декстрин, образует сероводород, редуцирует хлорид тетразола, мочевину не расщепляет.

Для идентификации микоплазм предложена реакция иммунофлуоресценции. На поверхность агаровой среды в чашках засева­ют микоплазмы, чашки выдерживают в термостате 3...5 дней. Затем в них вносят 2 мл ФСБР на 30 мин, сливают и наносят на агар 2 мл меченой ФИТЦ-антисыворотки в рабочем титре (при непрямом методе применяют немеченую сыворотку), выдержи­вают при 37 °С 30 мин, сливают и трижды промывают буфером, после чего просматривают колонии под люминесцентным мик­роскопом. Колонии, окрашенные гомологичной сывороткой, ярко флуоресцируют. Для изучения антигенной структуры микоплазм применяют реакцию диффузионной преципитации в агаровом геле (РДП). При постановке реакции используют ра­створимый антиген, который получают путем многократного за­мораживания и оттаивания микоплазм (до 20 раз), воздействия ультразвуком (при 20 кГц — 3 мин) или детергентами (твин-20, додецилсульфат натрия).

Биопроба. Заражают двух-трех здоровых телят 6...8-месячного возраста подкожно в область подгрудка, интратрахеально или интраплеврально экссудатом от больных животных или культу­рой. За животными ведут наблюдение в течение 30 дней. В поло­жительных случаях телята заболевают на 2...7-й день, температу­ра поднимается до 40...41 °С, развивается общая интоксикация организма; при подкожном методе заражения в месте введения образуется флегмона, в процесс вовлекаются регионарные лим­фоузлы. Гибель обычно наступает через 17 сут.

Серологическая диагностика включает в себя постановку РСК, РИГА, проведение ИФА. Для прижизненного выявления больных применяют РСК, которую ставят по общепринятой методике. Антиген для реакции готовят на биофабри­ках из плевральной жидкости от экспериментально зараженных животных; выпускают и культуральные антигены. В качестве диагностического теста используют реакцию непрямой гемагглютинации, чувствительность которой в острой фазе болезни выше, чем чувствительность РСК. Для определения специфических ан­тител к микоплазмам в сыворотке крови животных применяют метод иммуноферментного анализа.

Инфекционная плевропневмония коз. Это контагиозное заболе­вание коз всех пород и возрастов. Характеризуется воспалением легких, плевры, серозным воспалением междолевой серозной ткани, скоплением экссудата в плевральной полости.

Возбудитель инфекционной плевропневмонии коз — М. mycoides subsp. capri, род Mycoplasma, семейство Mycoplasmataceae.

Лабораторная диагностика инфекционной плевропневмонии коз основана на результатах бактериологического исследования.

Бактериологическое исследование вклю­чает в себя обнаружение возбудителя в исходном материале ме­тодом световой микроскопии, выделение чистой культуры посе­вом на питательные среды и идентификацию возбудителя по культурально-морфологическим, ферментативным и патогенным свойствам.

Материал для исследования. В лабораторию направляют серд­це, легкие, бронхиальные и средостенные лимфатические узлы, экссудат грудной полости, печень, селезенку павших или вынуж­денно убитых животных. Экссудат из грудной полости набирают стерильным шприцем (2...5 мл). Для исследования пригоден све­жий материал, который пересылают в лабораторию в стерильной посуде в термосе со льдом или в замороженном состоянии. Замо­роженный материал хранят не более 10сут.

Микроскопия препаратов из исходного материала. Мазки-отпе­чатки фиксируют этанолом 15...20 мин, окрашивают при комнат­ной температуре в течение 24 ч краской Романовского—Гимзы, разведенной дистиллированной водой в соотношении 1: 10, пос­ле чего промывают и микроскопируют. В положительных случаях обнаруживают мелкие полиморфные образования кокковидной, кольцевидной, нитевидной форм розового цвета. В мазках, окра­шенных по Граму, наблюдают грамотрицательно окрашенную аморфную массу.

Выделение и идентификация культуры возбудителя. Для выделе­ния культуры возбудителя инфекционной плевропневмонии коз применяют жидкие питательные среды Мартена, Эдварда и триптический перевар сердца крупного рогатого скота. Посевы помещают в термостат при 37...38 º С на 5...7 дней.

На жидких средах рост возбудителя проявляется незначитель­ным помутнением или опалесценцией, на агаре — мелкими ро­синчатыми колониями. Под малым увеличением микроскопа у них обнаруживают темный, врастающий в агар центр и светлую периферийную зону. Колонии напоминают по внешнему виду яичницу-глазунью.

Возбудитель ферментирует глюкозу, маннозу, сахарозу, вызы­вает разжижение свернутой сыворотки и гидролиз желатины, фосфатазная активность не выражена.

Биопроба. Для подтверждения диагноза инфекционной плев­ропневмонии коз ставят биопробу на двух 6... 12-месячных козля­тах. Для заражения используют 3...4-суточную свежевыделенную культуру микоплазм или суспензию из исследуемого материала на физиологическом растворе

(1: 10). Козлят заражают внутри-плеврально по 10 мл. В положительных случаях у животных через 2... 15 дней отмечают повышение температуры тела, одышку. Ги­бель наступает через 1...3 нед. Из пораженных легких и плевраль­ного экссудата выделяют культуру возбудителя.

Инфекционная агалактия овец и коз. Контагиозное заболева­ние. Характеризуется прекращением лактации, поражением мо­лочной железы, глаз и суставов. У беременных животных прояв­ляется абортами. Гибель животных при остром течении болезни наступает через 5...8 дней.

Возбудитель — микоплазма М. agalactiae, род Mycoplasma.

Лабораторная диагностика инфекционной агалактии мелкого рогатого скота основана на результатах бактериологического и серологического исследований.

Бактериологическое исследование вклю­чает в себя обнаружение возбудителя в исходном материале ме­тодом световой микроскопии и биопробы. При отрицательных результатах биопробы выделяют чистую культуру посевом на пи­тательные среды и идентифицируют возбудитель по культураль­но-морфологическим и ферментативным свойствам.

Материал для исследования. При заболевании вымени в лабо­раторию направляют молоко, при поражении суставов — синови­альную жидкость; от павших животных — паренхиматозные органы, лимфатические узлы, пораженную часть вымени, пора­женный глаз, синовиальную жидкость.

Микроскопия препаратов из исходного материала. Мазки-отпе­чатки окрашивают по Граму и по Романовскому—Гимзе. В пре­паратах, окрашенных по Романовскому—Гимзе, в положительных случаях выявляют мелкие полиморфные образования розо­вого цвета кокковидной, кольцевидной или нитевидной формы.

Выделение и идентификация культуры возбудителя. Возбудитель растет на агаре и в бульоне Мартена с добавлением 15...20 % сы­воротки лошади или крупного рогатого скота; на средах Эдварда и Хоттингера с добавлением сыворотки и 1...2% лактозы, на триптическом переваре сердца крупного рогатого скота.

На жидких средах на 5...7-й день появляется слабая опалес­ценция или незначительное помутнение. На плотных средах об­разуются мелкие колонии, напоминающие яичницу-глазунью (просматривают с помощью линзы). При отсутствии роста про­водят не менее 5 последовательных пассажей с интервалом 5...7 дней. Отсутствие роста в 5...7-м пассажах указывает, что исследу­емый материал не содержит возбудитель инфекционной агалактии мелкого рогатого скота. Микоплазмы также выращивают в клеточных культурах, используя клетки почки эмбриона овцы, куриные фибробласты.

М. agalactiae не ферментирует глюкозу и маннозу, не гидролизует аргинин и желатину, не разжижает свернутую сыворотку, обладает фосфатазной активностью.

Биопроба. Ставят на кроликах массой 2, 5...3 кг или на живот­ном того вида (овцы или козы 1...2-месячного возраста), от кото­рого выделена культура. Для заражения используют суспензию исследуемого материала, обработанную ингибиторами (ацетат таллия и пенициллин), или чистую культуру микоплазм. Кроли­ков заражают введением в переднюю камеру глаза 0, 1...0, 2 мл ма­териала с предварительным удалением тонкой иглой из камеры 0, 1...0, 05 мл жидкости. В другой глаз для контроля таким же об­разом вводят стерильный бульон. Через 5...12 дней в положитель­ном случае у подопытных кроликов развивается кератит. Наблю­дение ведут в течение 30 дней. При наличии кератита биопробу считают положительной, выделение культуры необязательно.

Овец и коз заражают, вводя материал в молочный канал, или подкожно по 5 мл, или в сустав по 2 мл. В положительных случа­ях через 2...30 дня после введения материала у животных развивается клиническая картина инфекционной агалактии мелкого рогатого скота.

Срок исследования без постановки биопробы 30 дней, с био­пробой и последующим выделением возбудителя — до 90 дней.

Серологическая диагностика основана на ре­зультатах исследования сывороток в РСК.

Респираторный микоплазмоз птиц. Это контагиозная болезнь кур и индеек. Характеризуется поражением органов дыхания. У птиц развивается катаральный ринит с последующей одышкой, каш­лем; катаральный ринит переходит в серозно-фибринозный, у некоторых птиц возникают конъюнктивит, синусит, припухлость в области межчелюстного пространства. Птица становится мало­подвижной, оперение взъерошено, гребень бледный, снижаются приросты массы у молодняка и яйценоскость у несушек. У индеек типичный признак — воспаление подглазничных синусов. У взрослой птицы заболевание может протекать бессимптомно.

Возбудитель — М. gallinarum, род Mycoplasma.

Лабораторная диагностика респираторного микоплазмоза птиц основана на результатах бактериологического и серологического исследований.

Бактериологическое исследование вклю­чает в себя обнаружение возбудителя в исходном материале ме­тодом световой микроскопии, выделение чистой культуры и идентификацию возбудителя по культурально-морфологическим, ферментативным и патогенным свойствам.

Материал для исследования. От свежих трупов птиц берут со-скобы со слизистых оболочек гортани, трахеи, головной мозг, а также кусочки легкого и стенки воздухоносных мешков. При от­сутствии патологических изменений у взрослой птицы на иссле­дование направляют легкие, желточный мешок, трахею эмбрио­нов последних дней инкубации и 1...2-суточных цыплят.

Микроскопия препаратов из исходного материала. В мазках, ок­рашенных по методу Романовского—Гимзы, микоплазмы обна­руживают в виде мельчайших полиморфных коккобактерий фио­летового или голубого цвета, беспорядочно расположенных по всему полю зрения (рис. 114).

Выделение и идентификация культуры возбудителя. Посевы из исследуемого материала делают на среды Эдварда, Хоттингера, Мартена.

Рост возбудителя микоплазмоза на жидких средах характери­зуется едва заметной опалесценцией или нежным помутнением среды. На плотных средах микоплазмы образуют круглые мелкие бесцветные колонии с гладкой или пуговчатой поверхностью, хо­рошо различимые при малом увеличении микроскопа. Для акти­визации роста микоплазм проводят не менее 5 пассажей с интер­валами между посевами в 5 дней. Посевы инкубируют при темпе­ратуре 37...38 °С.

Возбудитель микоплазмоза птиц утилизирует глюкозу, маннозу, мальтозу, образует аммиак, редко сероводород, индол. Не гидролизует желатину и аргинин, не обладает фосфатазной ак­тивностью, агглютинирует эритроциты птиц.

Биопроба. Для определения патогенности выделенных мико­плазм куриные или индюшиные

9-дневные эмбрионы заражают в хорионаллантоисную полость культурой на жидкой питательной среде по 0, 2 мл. Используют не менее 15 эмбрионов. Яйца инкубируют при 38...40°С и ежедневно просматривают в овоско­пе. При вскрытии эмбрионов, погибших через 48 ч и позднее, от­мечают дегенеративные изменения: артриты, отеки и кровоизли­яния на коже головы, теле, лапках, застойные явления в парен­химатозных органах, пневмонию. Наличие возбудителя опреде­ляют при посевах на специальные питательные среды. Биопробу считают положительной при гибели не менее 50 % зараженных эмбрионов и выживании контрольных.

Серологическая диагностика включает в себя постановку следующих реакций: капельной агглютинации с цельной кровью или сывороткой крови; торможения гемагглютинации (РТГА), ингибирования роста, РСК, а также применяют метод иммунофлуоресценции. Серологические методы диагнос­тики микоплазмоза птиц еще недостаточно совершенны.

Биопрепараты. Антиген для диагностики респираторного ми­коплазмоза птиц (лиофилизированный) готовят из штамма М. gallisepticum S6. Антиген применяют в сывороточно-капельной реакции агглютинации на стекле для постановки эпизоотическо­го диагноза на респираторный микоплазмоз птиц.

Риккетсиозы. Риккетсии относят к группе грамотрицательных бактерий — облигатных внутриклеточных паразитов. В зависимости от способа размножения их подразделяют на два порядка: Rickettsiales и Chlamydiales. В порядок Rickettsiales вклю­чено 3 семейства: Rickettsiaceae, Bartonellaceae и Anaplasmataceae.

В семейство Rickettsiaceae включены мелкие палочковидные и диплококковидные внутриклеточные микроорганизмы, чаще обитающие в тканях членистоногих, способные вызвать заболе­вание у животных и человека.

По морфологии различают четыре основных типа риккетсии: кокковидные (диаметр 0, 3... 1 мкм); палочковидные биполярные (1...1, 5 мкм); удлиненные биполярные, часто изогнутые (З...4мкм); нитевидные полизернистые (10...40 мкм) (рис.115). Кокковидные формы окрашиваются по Романовскому—Гимзе и Цилю—Нильсену в красный цвет, палочковидные и нитевид­ные — в красно-голубой (зерна красные, цитоплазма между ними голубая); по Здродовскому — в красный. Метод Здродовского — облегченная модификация способа Циля—Нильсена (карболо­вый фуксин Циля разводят в следующем соотношении: 10... 15 капель на 10 мл дважды дистиллированной воды или фосфатного буфера рН 7, 4). Тонкослойный препарат высушивают на воздухе и фиксируют над пламенем, окрашивают разведенным фуксином в течение 5 мин. Затем промывают водой, быстро (1...3 с) обраба­тывают кислотой (0, 5%-й раствор лимонной, 0, 15%-й раствор ук­сусной и др.), промывают водой и докрашивают 0, 5%-м водным раствором метиленовой сини 10 с, промывают, подсушивают фильтровальной бумагой.

Риккетсии размножаются делением. Вне организма развива­ются только в культуре растущей и переживающей ткани, на обо­лочках куриных эмбрионов.

Ку-риккетсиоз (Ку-лихорадка) (от англ. query — сомнения, со­мневаться). Природно-очаговая зооантропонозная болезнь до­машних, промысловых и диких млекопитающих животных и птиц. Протекает чаще бессимптомно, но может встречаться так­же в острой и хронической формах. Клинические признаки бо­лезни: повышение температуры, ринит, пневмония, конъюнкти­вит, поражение половых органов, маститы, у быков — орхиты, рождение нежизнеспособного потомства, аборты.

Возбудитель Ку-риккетсиоза — Coxiella burneti, род Coxiella, семейство Rickettsiaceae.

Лабораторная диагностика Ку-риккетсиоза основана на ре­зультатах бактериологического и серологического исследований.

Бактериологическое исследование вклю­чает в себя обнаружение возбудителя в исходном материале ме­тодом световой микроскопии и биопробы, выделение чистой культуры методом биопробы и идентификацию возбудителя по морфологическим и серологическим свойствам.

Материал для исследования. Для прижизненной диагностики в лабораторию направляют кровь из вены; клещей, собранных с животных; выделения из матки и влагалища; плаценты от абор­тировавших животных; от павших и убитых с диагностической целью животных берут участки пораженного легкого, головного мозга, селезенки, паренхимы вымени, регионарные лимфоузлы.

Микроскопия препаратов из исходного материала. При микро­скопии мазков, окрашенных по методам Романовского—Гимзы и Здродовского, можно обнаружить коккоподобные (диаметр 0, 2...0, 5 мкм), палочковидные (2 мкм) и нитевидные (10...12 мкм) формы, расположенные одиночно, попарно и короткими цепоч­ками, которые могут находиться внутри клеток тканей и вне кле­ток. По методу Здродовского риккетсии будут красного цвета на голубом фоне, по Романовскому—Гимзе кокковидные формы красные; палочковидные и нитевидные красно-голубые (рис. 116).

Выделение и идентификация культуры возбудителя. Из исходно­го материала готовят суспензию на физиологическом растворе (1: 10), в которую добавляют антибиотики и вводят 0, 2...0, 25 мл в желточный мешок 5...6-суточных куриных эмбрионов. Проводят 4...6 пассажей. При положительном результате отмечают отстава­ние в развитии и гибель зараженных эмбрионов. Риккетсии об­наруживают микроскопически в мазках, приготовленных из обо­лочек желточного мешка. Иногда используют культуры клеток куриных и мышиных фибробластов.

Для обнаружения и идентификации возбудителя используют реакцию иммунофлуоресценции, метод иммуноферментного анализа.

Биопроба. Для выделения риккетсии Бернета и подтверждения их патогенности заражают двух молодых морских свинок (массой 250...300 г) или четырех молодых белых мышей исходным мате­риалом (суспензия на физиологическом растворе 1: 5, обрабо­танная антибиотиком) или эмбриональной культурой. Материал вводят внутрибрюшинно свинкам по 3...5 мл и мышам по 0, 5... 1 мл. Для получения более четких результатов проводят от 3 до 5 «слепых» пассажей. В последних пассажах у морских свинок через 3...10 дней после заражения появляется лихорадка, и жи­вотные через 3...12 дней погибают, при вскрытии у них отмечают увеличение печени, селезенки и лимфоузлов.

Серологическая диагностика основана на ре­зультатах РСК, в которой исследуют сыворотки крови больных животных. При получении положительных результатов (на 3 и 4 креста) реакцию повторяют для подтверждения полученных дан­ных.

Эрлихиоз собак. Это трансмиссивная лихорадочная болезнь. Характеризуется истощением, панцитопенией, геморрагиями на коже и слизистых оболочках. Возбудитель — Е. canis, род Erlichia, семейство Rickettsiaceae. Наиболее восприимчивы к эрлихиозу собак немецкая овчарка и гончая, болеют лисы, макаки-резус, койоты. Лабораторные животные (мыши, крысы, морские свин­ки, хомячки) и куриные эмбрионы нечувствительны. Морфоге­нез возбудителя складывается из превращения элементарного тельца овальной или кокковидной формы (0, 4 мкм) в инициаль­ное тельце неопределенной формы размером 1...2мкм с последу­ющей трансформацией в морулу (образования похожи на туто­вую ягоду 2...4 мкм). Цикл развития завершается распадом морулы на элементарные тельца.

Лабораторная диагностика эрлихиоза собак заключается в све­товой микроскопии мазков крови, окрашенных по Романовско­му—Гимзе, для определения морул возбудителя в лейкоцитах со­бак. Морулы обнаруживают, начиная с третьей недели болезни на протяжении 2...5 лет. Все формы Е. canis окрашиваются по Гимзе в голубой цвет, по Романовскому — в розовый.

Как метод серологической диагностики применяют непрямую реакцию иммунофлуоресценции с использованием зараженной культуры моноцитов в качестве антигена.

Эрлихиоз крупного и мелкого рогатого скота. Это трансмиссив­ная лихорадочная болезнь. У овец развиваются пневмонии, абор­ты, у баранов — бесплодие, у коров отмечают лихорадку, вялость, снижение удоев.

Возбудитель — Erlichia phagocytophila.

Лабораторная диагностика эрлихиоза крупного и мелкого рога­того скота основана на микроскопическом изучении окрашен­ных препаратов из материала. Морфологические и тинкториальные свойства возбудителя аналогичны Е. canis.

Гидроперикардит (коудриоз). Это заболевание жвачных и все­ядных животных. Характеризуется лихорадкой, геморрагическим диатезом с образованием серозного экссудата в грудной и брюш­ной полостях.

Возбудитель — Cowdria ruminantum, род Cowdria, семейство Rickettsiaceae.

Лабораторная диагностика гидроперикардита основана на мик­роскопическом изучении окрашенных препаратов и на результа­тах биопробы.

Материал для исследования. В лабораторию направляют кровь от больного животного, костный мозг, селезенку.

Микроскопия препаратов из исходного материала. В положи­тельных случаях в окрашенных препаратах из материала обнару­живают кокковидные, эллипсоидные (0, 2...0, 5 мкм) или палочковидные клетки размером (0, 2...0, 3) х (0, 4...0, 5) мкм, расположен­ные в вакуолях цитоплазмы клеток эндотелия, где образуют спе­цифические компактные колонии. По Граму окрашивается отрицательно, по Гимзе — в темно-синий цвет. Особенно важное диагностическое значение имеет обнаружение возбудителя в эн­дотелии капилляров коры головного мозга.

Биопроба. Заражают естественно-восприимчивых животных путем внутривенного введения крови больного.

Хламидиозы. Возбудителей хламидиозов относят к порядку Chlamydiales, семейству Chlamydiaceae, включающему в себя один род Chlamydia с двумя видами: С. trachomatis и С. psittaci. Это грамотрицательные неподвижные кокковидные облигатные паразиты с выраженным полиморфизмом. С. trachomatis патоге­нен для человека и мышей, С. psittaci вызывает ряд инфекцион­ных заболеваний у животных и птиц. Развитие патологического процесса зависит от места локализации возбудителя у живот­ных. Хламидии чаще поражают респираторные органы и ки­шечный тракт у птиц, ягнят, телят, поросят, гениталии у круп­ного и мелкого рогатого скота, синовиальные ткани телят, по­росят, ягнят, жеребят, слизистые оболочки глаз крупного рога­того скота, свиней, овец, кошек и др. Клинические проявления хламидиоза разнообразны: диарея, пневмонии, конъюнктиви­ты, полиартриты, перикардиты, энцефалиты, аборты, мертво-рождение, бесплодие, вагиниты, эндометриты и т. д. К С. psittaci восприимчивы дикие и домашние птицы — свыше 130 видов. Из домашних птиц чаще болеют утки, индейки, гуси, реже — куры, голуби (орнитоз).

Лабораторная диагностика хламидиозов основана на результа­тах бактериологического и серологического исследований.

Бактериологическое исследование вклю­чает в себя обнаружение возбудителя в исходном материале ме­тодом световой и люминесцентной микроскопии, выделение чи­стой культуры методом биопробы и идентификацию возбудителя по морфологическим свойствам.

Материал для исследования. От павших или вынужденно уби­тых животных в лабораторию направляют кусочки паренхима­тозных органов; при аборте — плод целиком или паренхиматоз­ные органы и сычуг; для прижизненной диагностики — пробы эякулята или замороженной спермы, кровь для серологических исследований. Материал берут в течение двух часов после гибе­ли, убоя или аборта, помещают в термос со льдом.

Микроскопия препаратов из исходного материала. Для световой микроскопии мазки из материала окрашивают по Романовско­му—Гимзе (хламидии в зависимости от стадии развития окраше­ны в красно- или сине-фиолетовый цвет), Стемпу. При окраске по Стемпу препараты фиксируют нагреванием, окрашивают фук­сином Циля, разведенным дистиллированной водой в соотноше­нии 1: 5 (рН 7, 4) 15 мин, промывают дистиллированной водой, обрабатывают 0, 05%-м раствором серной кислоты 1 мин, вновь промывают дистиллированной водой, докрашивают 1%-м вод­ным раствором малахитовой зелени 30 с, после чего промывают водой и микроскопируют: хламидии ярко-красные на зеленова­том фоне клеток. При иммунофлуоресцентном выявлении хла­мидии в материале используют прямой и непрямой варианты. В зависимости от этапа морфогенеза размеры хламидий варьируют от 0, 2...0, 4 до 0, 6... 1, 5 мкм.

Выделение и идентификация культуры возбудителя. Для выделе­ния хламидий используют 6...7-дневные куриные эмбрионы или лабораторных животных. Из материала готовят суспензию на физиологическом растворе (1: 10), центрифугируют, надосадочную жидкость обрабатывают антибиотиками (100ЕД/мл пени­циллина, 500ЕД/мл стрептомицина) при 4 º С 24 ч, одновременно контролируя на стерильность. Затем исследуемый материал в объеме 0, 2 мл вводят в желточный мешок. Эмбрионы инкубиру­ют в термостате при 37 °С и относительной влажности 75 %. Эмбрионы, погибшие на 4... 12-й день, вскрывают, аллантоисную жидкость контролируют на бактериальную контаминацию. Из желточных мешков готовят мазки-отпечатки и исследуют на на­личие хламидий методом микроскопии. При отсутствии специ­фической гибели эмбрионы на 12-е сутки вскрывают и проводят второй пассаж, при необходимости — и третий.

Биопроба. Для выделения хламидий на лабораторных живот­ных заражают пять белых мышей или две-три морские свинки. Материал, подготовленный ранее описанным способом, вводят внутрибрюшинно или интраторакально мышам по 0, 3 мл, морс­ким свинкам — по 0, 5 мл. Наблюдение ведут в течение 10сут. В положительных случаях животные погибают на 7... 10-е сутки. При вскрытии обнаруживают большое количество серозно-фибринозного экссудата в грудной и брюшной полостях, очаговую пневмонию, кровоизлияния под легочной плеврой. При отсут­ствии гибели животных проводят слепые пассажи. Обнаружение и идентификацию хламидий проводят, как описано ранее.

Серологическая диагностика основана на ре­зультатах РСК или РДСК. Сыворотки исследуют в разведении 1: 5 и 1: 10, положительным считают задержку гемолиза на два — четы­ре креста в разведении 1: 10, сомнительным — на один крест в разведении 1: 10 и на один — четыре креста в разведении 1: 5.

Биопрепараты. Инактивированная эмульгированная вакцина против хламидиозного аборта овец.

Набор антигенов и сывороток для серологической диагности­ки хламидиозов сельскохозяйственных животных.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

1. Описать характер роста микоплазм на плотных и жидких питательных средах.

2. Промикроскопировать окрашенные препараты из культур микоплазм.

3. Окрасить и промикроскопировать мазки-отпечатки, содержащие хламидии.

4. Ознакомиться с биопрепаратами.

Контрольные вопросы

1. Каковы морфологические, тинкториальные и культуральные свойства микоплазм?

2. В чем заключается бактериологическая диагностика микоплазмозов?

3. На чем основана серологическая диагностика микоплазмозов?

4. Как классифицируют хламидии?

5. Какие методы применяют для лабораторной диагностики риккетсиозов и
хламидиозов?