Получение клинического генетического материала

Для проведения ПЦР используют ДНК клеток различных органов и тканей человека. Основными требованиями, предъявляемыми к такой ДНК, является отсутствие сильной ее деградации и повреждений химическими агентами. Источниками клеток для выделения ДНК служат слюна и другие биологические жидкости пациентов, свежая или высушенная кровь, биоптаты различных тканей, в том числе и корни волос, а также консервированные ткани.

Слюну пациентов (до 5 мл) обычно собирают в пластиковые пробирки. Допускается сбор слюны на фильтровальную бумагу с последующим ее высушиванием с целью облегчения транспортировки. Поскольку источником ДНК в слюне являются соматические клетки слизистых, а также присутствующие в ротовой полости микроорганизмы, необходимо предпринимать усилия для их механического освобождения с внутренней поверхности щек, например движениями языка или используя специальные щеточки. В лаборатории белки слюны расщепляют протеиназой К, а освободившуюся ДНК дополнительно депротеинизируют фенолом и концентрируют осаждением спиртом.

Корни волос содержат несколько сотен соматических клеток, а следовательно, и адекватное число копий ДНК, достаточное для проведения ПЦР. При использовании ДНК из этого источника из-за малого ее содержания необходимо применять особые меры предосторожности против ее загрязнения посторонними ДНК. Преимуществом корней волос перед другими источниками ДНК является почти полное отсутствие внеклеточного матрикса, затрудняющего выделение ДНК из соматических клеток. Это позволяет исключать стадию фенольной обработки образцов для получения ДНК, пригодной для проведения ПЦР. Клетки корней волос лизируют буфером, содержащим неионные детергенты, белки гидролизуют протеиназой К, которую далее инактивируют прогреванием при 100^о. При этом одновременно происходит денатурация ДНК, что необходимо для проявления ее матричных свойств при проведении ПЦР.

Срезы для микроскопии и парафинированные ткани используют для проведения семейного генетического анализа, когда другие возможные источники ДНК недоступны из-за смерти пациента или по другим причинам. Для фиксации тканей при проведении патологоанатомических исследований часто используют формальдегид или глутаровый альдегид, которые модифицируют основания ДНК. Поэтому при использовании ДНК из срезов фиксированных тканей возможна амплификация лишь коротких ее сегментов длиной в несколько сотен пар оснований.

Ткани, освобожденные от парафина ксилолом или октаном или же соскобленные с препаратов для микроскопии, суспендируют в лизирующем буфере с протеиназой К и инкубируют в течение 12–24 ч при 56–65^о для протеолитического расщепления белков. Дальнейшую депротеинизацию образцов и осаждение ДНК осуществляют так же, как и в предыдущем случае.