Схема 1. Последов ателье ость атшгоа ври биохимических исследованиях Эош ассмюив» 06wt ятоаедоюм 5 страница

Растворение связано с гидратацией белков, т. е. связыванием молекул воды с белками. Гидратная вода так прочно связана с макромолекулой белка, что отделить ее удается с большим трудом. Это говорит не о простой адсорб­ция, а об электростатическом связывании молекул воды с полярными группа­ми боковых радикалов кислых аминокислот, несущих отрицательный заряд, и основных аминокислот, несущих положительный заряд.

Однако часть гидратной воды связывается пептидными группами, которые образуют с молекулами воды водородные связи. Например, полнпептиды с неполярными боковыми группами тоже набухают, т. е. связывают воду. Так, большое количество воды связывает коллаген, хотя этот белок содержит пре­имущественно неполярные аминокислоты. Вода, связываясь с пептидными группами, раздвигает вытянутые полипептидные цепи. Однако межцепочечные связи (мостики) не дают молекулам белка отрываться друг от друга и перехо­дить в раствор При нагревании сырья, содержащего коллаген, межцепочеч­ные мостики в коллагеновых волокнах разрываются и освобожденные- поли- пептидные цепи переходят в раствор. Эта фракция частично гидролизован- ного растворимого коллагена называется желатиной. Желатина по химиче­скому составу близка к коллагену, легко набухает и растворяется в воде, образуя вязкие жидкости. Характерным свойством желатины является способ­ность к гелеобразованию. Водные растворы желатины широко используются в лечебной практике как плазмозамещающее и кровоостанавливающее сред­ство, а способность к гелеобразованию — при изготовлении капсул в фарма­цевтической практике.

Факторы, влияющие на растворимость белков. Растворимость разных белков колеблется в широких пределах. Она определяется их аминокислотным составом (полярные аминокислоты придают большую растворимость, чем не­полярные), особенностями организации (глобулярные белки, как правило, лучше растворимы, чем фибриллярные) и свойствами растворителя..Напри­мер, растительные белки — проламины — растворяются в 60—80%-ном спир­те, альбумины — в воде н в слабых растворах солей, а коллаген н кератины нерастворимы в большинстве растворителей-

Стабильность растворам белков придают заряд белковой моле­кулы и гидратная оболочка. Каждая макромолекула индивиду­ального белка имеет суммарный заряд одного знака, что препятствует их склеиванию в растворе и выпадению в осадок. Все, что способствует сохране­нию заряда и гидратной оболочки, облегчает растворимость белка и его устой­чивость в растворе. Между зарядом белка (или числом полярных аминокислот в нем) и гидратацией существует тесная связь: чем больше полярных амино­кислот в белке, тем больше связывается воды (в расчете на 1 г белка). Гид- ратная оболочка белка иногда достигает больших размеров, и гидратная вода может составлять до */в ^ег0 массы.

Правда, некоторые белки гидратируются сильнее, а растворяются хуже. Например, коллаген связывает воды больше, чем многие хорошо растворимые глобулярные белки, но не растворяется. Его растворимости мешают структур­ные особенности — поперечные связи между полипептидными цепями. Иногда разноименно заряженные группы белка образуют много ионных (солевых) связей внутри молекулы белка или между молекулами белков, что мешает образованию связей между молекулами воды и заряженными группами бел­ков. Наблюдается парадоксальное явление: в белке много анионных или кати- онных групп, а растворимость его в воде низкая. Межмолекулярные солевые мостики вызывают склеивание молекул белка и их выпадение в осадок.

Какие же факторы среды влияют на растворимость белков и их стабиль­ность в растворах?

Влияние нейтральных солей. Нейтральные соли, в небольших концентра­циях повышают растворимость даже тех белков, которые нерастворимы в чис­той воде (например, эвглобулины). Это объясняется тем, что ионы солей, взаимодействуя с противоположно заряженными группами молекул белков, разрушают солевые мостики между молекулами белков. Повышение концен­трации солей (увеличение ионной силы раствора) оказывает обратное дей­ствие (см. ниже — высаливание).

Влияние рН среды. рН среды влияет на заряд белка, а следовательно, на его растворимость. Наименее устойчив белок в иэоэлектрнческом состоянии, т. е. когда его суммарный заряд равен нулю. Снятие заряда позволяет молеку­лам белка легко сближаться, склеиваться и выпадать в осадок. Значит, рас­творимость и устойчивость белка будут минимальны при рН, соответствующем изоэлектрическон точке белка.

Влияние температуры. Строгой зависимости между температурой и ха­рактером растворимости белков не имеется. Одни белки (глобулины, пепсин, фосфорилаза мышц) в водных или солевых растворах с повышением темпера туры растворяются лучше; другие (альдолаза мышц, гемоглобин и т.д.) хуже.

Влияние раз незаряженного белка. Если в раствор белка, являющегося полианионом (кислый белок), добавить белок, являющийся поликатионом (основной белок), то онн образуют агрегаты. При этом устойчивость вслед­ствие нейтрализации зарядов теряется и белки выпадают в осадок. Иногда эту особенность используют для выделения нужного белка из смеси белков.

Высаливание

Растворы нейтральных солей широко используются не только для повышения растворимости белка, например при выделении его'из биологического материа­ла, но и для избирательного осаждения разных белков, т. е. их фракциониро­вания. Процесс осаждения белков нейтральными солевыми растворами на­зывается высаливанием. Характерной особенностью белков, полученных вы­саливанием, является сохранение ими нативных биологических свойств после удаления соли.

Механизм высаливания состоит в том, что добавляемые анионы и катионы солевого раствора снимают гидратную оболочку белков, являющуюся одним из факторов его устойчивости. Возможно, одновременно происходит и нейтра­лизация зарядов белка ионами соли, что также способствует осаждению белков.

Способность к высаливанию наиболее выражена у анионов солей. По силе.высаливающего действия анионы и катионы располагаются в следующие ряды:

SC^-> C_eH, O^a₇-> CH_S|COO-> C)-> NOr> Br-> I-> CNS- Na⁺ > К⁺ > Rb⁺ > 'Cs+

Эти ряды называются лиотропными.

Сильным высаливающим эффектом в этом ряду обладают сульфаты. На практике для высаливания белков чаще всего применяют сульфат натрия и аммония. Кроме солей белки осаждают органическими водоотнимающнмн средствами (этанол, ацетон, метанол и др.). Фактически это то же выса­ливание.

Высаливание широко используют для разделения и очистки белков, по­скольку многие белки различаются по размеру гидратной оболочки и вели­чине зарядов. Для каждого из них имеется своя зона высаливания, т. е. кон­центрация соли, позволяющая дегидратировать и осадить белок. После удале­ния высаливающего агента белок сохраняет все свои природные свойства и функции.

Денатурация (денатнвация) и рекатурацня (ренативдцня)

При действии различных веществ, нарушающих высшие уровни организации белковой молекулы (вторичную, третичную, четвертичную) с сохранением первичной структуры, белок теряет свои нативные физико-химические и, глав­ное, биологические свойства. Это- явление называется денатурацией (денати- вацией). Оно характерно только для молекул, имеющих сложную простран- < ^гвенную организацию. Синтетические и природные пептиды не способны к •Денатурации.

При денатурации разрываются связи, стабилизирующие четвертичную, третичную и даже вторичную структуры. Полипептидная цепь разворачива­ется и находится в растворе или в развернутом виде, или в виде беспорядоч­ного клубка. При этом теряется гндратиая оболочка и белок выпадает в осадок Однако осажденный денатурированный белок отличается от того же белка, осажденного путем высаливания, так как в первом случае он утрачи­вает нативные свойства, а во втором сохраняет. Это указывает на то, что механизм действия веществ, вызывающих денатурацию и высаливание, раз­ный. При высаливании сохраняется нативная структура белка, а при денату­рации разрушается.

Денатурирующие факторы делятся на физические и химические. К фи­зическим факторам относятся: температура, давление, механическое воз­действие, ультразвуковое и ионизирующее излучение.

Тепловая денатурация белков является наиболее изученным процессом. Она считалась одним из характерных признаков белков. Давно известно, что при нагревании белок, свертывается (коагулирует) и выпадает в осадок. Большинство белков термолабильны, однако известны белки, очень устойчи­вые к нагреванию. Например, трипсин, хнмотрнпсин, лизоцим, некоторые бел­ки биологических мембран. Особой устойчивостью к температуре отличаются белкн бактерий, обитающих в горячих источниках. Очевидно, у термостабиль­ных белков тепловое движение полипептидиых цепей, вызванное нагреванием, недостаточно для разрыва внутренних связей молекул белка. В изоэлектриче­ской точке белки легче подвергаются тепловой денатурации. Этот прием используется в практической работе. Некоторые белки, наоборот, денатури­руют при низкой температуре.

- К химическим факторам, вызывающим денатурацию, отно­сятся: кислоты и щелочи, Органические растворители (спирт, ацетон), детер­генты (моющие средства), некоторые амиды (мочевина, соли гуаниднна и т. д.), алкалоиды, тяжелые металлы (соли ртути, меди, бария, цинка, кадмия и т. д.). Механизм денатурирующего действия химических веществ зависит от их физико-химических свойств. Кислоты и щелочи широко исполь­зуются в качестве осадителей белков. Многие белки денатурируются при крайних значениях рН — ниже 2 или выше 10—И. Но.некоторые белки устойчивы к действию кислот и щелочей. Например, гистоны н протамины не денатурируются даже при рН 2 или рН 10. Крепкие растворы этанола, ацетон тоже оказывают денатурирующее влияние на белки, хотя для некото­рых белков эти органические растворители используются как высаливающие, агента.

Тяжелые металлы, алкалоиды издавна применяются как осадители; они образуют прочные связи с полярными группами белков и тем самым разрыва­ют систему водородных и ионных.связей.

Особо следует остановиться на мочевине и солях гуаниднна, которые в больших коцеитрациях (для мочевины 8 моль/л, для гуаниднна гидрохлорида 2 мать/л) конкурируют пептидными группами за образование водородных связей, В результате происходит доссоциация на субъединицы у белков с чет­вертичной структурой, а затем и разворачивание полипептидиых цепей. Это свойство мочевины настолько ярко, что его широко используют для доказа­тельства наличия четвертичной структуры белка и значения его структурной организации в осуществлении физиологической функции.

Свойства денатурированных белков. Наиболее типичными для денатури­рованных белков являются следующие признаки.

1. Увеличение числа реактивных или функциональных групп по сравне-' нию с нативной молекулой белка (функциональными группами называются группы боковых радикалов аминокислот: СООН, NH₂, SH, ОН). Часть этих групп обычно находится внутри молекулы белка и не выявляется специаль­ными реагентами. Развертывание полипептидной цепи при денатурации по­зволяет обнаружить эти дополнительные, или скрытые, группы.

гидратной оболочки, развертыванием молекулы белка с «обнажением» гидро­фобных радикалов и нейтрализацией⁵зарядов полярных групп).

3. Изменение конфигурации молекулы белка.

4. Потеря биологической активности, вызванная нарушением нативной структурной организации молекулы.

5. Более легкое расщепление протеолитнческими ферментами по срав­нению с нагивным белком — переход компактной нативной структуры в развернутую рыхлую форму облегчает доступ ферментов к пептидным связям белка, которые они разрртиают.

Последнее качество денатурированнрго белка Широко известно. Терми­ческая или иная обработка продуктов, содержащих белки (главным образом мясные), способствует лучшему перевариванию их с помощью протеолитиче- ских ферментов желудочно-кишечного тракта. В желудке человека и живот­ных вырабатывается природный денатурирующий агент — соляная кислота, которая, денатурируя белки, помогает их расщеплению ферментами. Однако наличие соляной кислоты и протеолитических ферментов не позволяет приме­нять белковые лекарственные препараты через рот, ибо они денатурируются и тут же расщепляются, теряя биологическую активность.

Заметим также, что денатурирующие вещества, осаждающие белки, используются в биохимической практике с иными целями, чем высаливающие. Высаливание как Прием применяется для выделения какого-то белка или группы белков, а денатурация для освобождения от белха смеси каких-либо -веществ. Удаляя белок, можно получить безбелковый раствор или устранить действие этого белка.

Долго считалось, что денатурация необратима. Однако в некоторых случаях удвленне денатурирующего агента (такие опыты были сделаны при использовании мочевины) восстанавливает биологическую активность белка. Процесс восстановления физико-химических и биологических свойств денату­рированного белка называется ренатурацией или ренативацией. Если денату­рированный белок (после удаления денатурирующих веществ) вновь само­организуется в исходную структуру, то восстанавливается и его биологиче­ская активность.

5. Выделение и искусственный синтез белков

Выбор методов выделения и очистки белка основывается на его свойствах (см. табл. 9). Для грубой очистки белков, как правило, используется несколько

приемов и методов; еще бблыиим разнообразием отличаются методы тонкой очистки белков, позволяющие добиться высокой степени однородности нуж­ного белка.

Методы изучения структуры белка. После выделения гомогенного белка исследуют его структурную организацию (первичную, вторичную, третичную и четвертичную). Основные методы н приемы, используемые для изучения структуры белков, перечислены в табл. 10. Как правило, для получения возможно более полной информации о высших уровнях структурной орга­низации белков используют несколько разных методов.

Таблица 10. Некоторые методы изучения разных уровней структурной организации белка

Метод изучения

Гидролиз {кислотный, ще­лочной, ферментативный) Ионообменная хроматогра­фия на анализаторе амино­кислот

Снквенация (на приборах сиквенаторах)

Спекгреколяримстрня (из­мерение угла вращения влоскопмяриз овэ якогО света па спектроволяря- метрах)

Разрыв пептидных свизей и получение смеси аминокислот

Определение аминокислотного состава путем раз­деления аминокислот, основанного на различиях в их кислотно-основных свойствах Установление порядка чередования аминокислот путем автоматического последовательного отсече­ния аминокислот от полипептидной цепи и их идентификации

Обнаружение регулярных структур о-спиралей и р-структур. Метод основан на способности амино­кислотных остатков пол, '.пептидной цепн вращать плоскость поляризованного свста влево. Находясь в. виде беспорядочного киубка, белок вращает плоскость тоже элево. а-Спирали и ^-структуры вращают плоскость поляризации света вправо. Чем больше степень регулярных структур (а- и p-структур) в белке, тем больше выражено правив, вращение

Установление степени епирализэцин белка (коли­чества а-спкралей).. Метод основан на определенен

УФ спектрофотометр и я (измерение степени погло­щения белков при 190 нм

И К спектроскопия (изме­рение спектра поглощения белков в инфракрасной об­ласти на инфракрасных спектрофотометрах)

Электронная микроскопия

Рентгеноетрупту р ы ы й

медленно обменивающегося водорода групп пептидных связей на дейтерий тяжелой воды (DjO). Медленно.обменивается водород пеп­тидных' связей в том случае, если он участвует 6 образовании межпептндных водородных связей. Чем больше медленно обменивающегося водорода белка, тем выше степень спирализацин Определение степени спирализацин белков (коли­чества а-спиралей). Метод основан на гнпохром- ном эффекте, т. е. пониженном поглощении света при 190 нм белком, находящимся в спиралиэо- ванном состоянии, по сравнению с аморфным (бес­порядочный клубок). (Пр> Г 190 нм максимум по­глощения пептидных групп.) По наличию гипо- хромного эффекта можно судить о степени спира­лизацин белка: чем он выраженнее, тем выше спиралнаацня

Установление наличия регулярных структур в белке по ориентации относительно оси макромо­лекулы групп —NH— к С=0 пептидных свявай. Метод основан на иамерекнн разности поглоще­ния ИК света, поляризованного ндоль н перпен­дикулярно осн ориентации молекулы белка Определение конфигурации белков и отдельных частей их молекул, например спиральных участков. Для повышения контрастности (электронной плот­ности) белков используют специальные покрытия, которые адсорбируются поверхностью белка. При облучении таких белков пучком ваектронов проис­ходит их поглощение контрастирующими яещест- вами (на пленке они темные), которые окружают белок н его структуры (на пленке они светлые) Установление пространственного расположения всех атомов а молекуле бежа. Метод основан на дифракции рептгеновского излучения электро­нами, окружающими ядра.атомов в кристалле белка, поскольку длина волны рептгеновского излучения соизмерима с межатомными расстоя­ниями в кристалле белхв. На фотопластинке, помещенной за кристазлом, рентгеновское излу­чение дает дифракционную картину, характерную для третичной структуры белка

> и для установления третичной струк-

Электронная микроскопия Рептгеиоструктуриый ана- Электрофорез

Установнсаие наличия рваных субъединиц в оли- гомере. Принцип основан на неодинаковой под­вижности в электрическом поле олнгомеров, со­стоящих из рааиых субъединиц, каждая из кото­рых имеет свой зарнд

Искусственный синтез белка. Очень трудоемкий процесс искусственного синтеза белка в настоящее время •автоматизирован. Искусственный синтез позволяет получать белки, абсолютно идентичные белкам человека и не
являющиеся чужеродными в отличие от аналогичных белков, выделенных из органов животных. При этом сохраняется дорогое природное сырье — тушки и органы животных.

В настоящее время синтезированы короткие пептиды (окситоцин, вазо- прессин, пептиды гипоталамуса), некоторые тропные белковые гормоны гипофиза — кортикотропин, соматотропнн, инсулин и т. д., которые могут применяться как лекарственные средства. Выпуск некоторых из них осу­ществляется в промышленных масштабах.

6. Классификация и номенклатура белков

Строгая классификация белков пока не разработана: Сделаны попытки классифицировать их по физико-химическим свойствам, функциональным и структурным признакам.

Физико-химическая классификация предусматривает деление белков по электрохимическим и полярным свойствам.

По электрохимическим признакам белки делятся на кислые (преобладают кислые функциональные группы; это полианиоиные белки), основные (преобладают основные функциональные группы; это поли- катионные белки) и нейтральные (число кислых и основных групп в молекуле белка сбалансировано).

По полярным признакам различают полярные, или гидрофиль­ные, белки (хорошо растворимы, содержат много полярных групп), непо­лярные, или гидрофобные (почти нерастворимы, содержат много неполярных остатков), и амфипатические, или амфифилбные (обладают двойственными признаками — одна часть молекулы кеполярна, а другая поляр на; как прави­ло, это мембранные белки).

Функциональная классификация, учитывающая биологические свойства белков, наиболее разработана для ферментных белков (см. раздел «Фермен­ты»), а в общем виде рассмотрена ниже (см. «Биологические функции бел­ков»).

По структурным признакам общепринято, как упоминалось ранее, деление белков на две большие группы: простые белки (синонимы — протеины, апо- протеины), структура которых представлена только полипептидной цепью, и 'сложные белки (синонимы — протеиды, голопротеиды), которые содержат небелковый компонент. Эта классификация учитывает общий принцип строе­ния белков, ню ее дальнейшее развитие встречает трудности.

Дело в том, что в чистом виде простые белки встречаются в организме очень редко, так как многочисленные реакционные группы белков способны взаимодействовать с небелковыми соединениями, образуя комплексы. Проще дать классификацию сложных белков по особенностям строения небелкового компонента (например, нуклеопротеиды, гликопротенды, липопротенды и т. д.), но и в этом случае возникают затруднения, так как, например, глико- протеиды можно называть и сложными белками, и сложными углеводами. Удобнее эти макромолекулы называть белок-небелковыми комплексами, которые являются разновидностью смешанных макромолекул.

Систематизации в номенклатуре белков, за исключением ферментных, тоже не существует. Название белкам дают по случайным признакам, учиты­вая преимущественно источник выделения или какие-то особенности раство­римости, конфигурацию молекул и т. д.

Простые белки

К простым белкам относят гистоны, протамины, альбумины, глобулины, проламины, глютелины и протеиноиды (или склеропротеины).

Гистоны (от греч. histos — ткань) '— тканевые белки многоклеточных организмов, связанных с ДНК хроматина. Это белки небольшой молекуляр­ной массы (3 3 000—24 000); по электрохимическим свойствам относятся к белкам с резко выраженными основными признаками (изоэлектрическая точка у разных гистонов колеблется в пределах 9, 5—32, 0). Гистоны имеют только третичную структуру. Выделяют 5 главных типов или фракций гисто­нов: Н[, Нг» Нгь, Нз, Н₄. Деление основано на ряде признаков, главным из которых является соотношение лизина и аргинина во фракциях (табл. 31).

Выделен дополнительный тип гистонов — гистон Н₅, содержащийся в ядерных эритроцитах птиц, амфибий и рыб. Имеются и некоторые другие модификации гистонов, но доля их невелика.

Отношение гистон/ДНК приближается к единице в тканях многоклеточ­ных организмов. В естественных условиях гистоны прочно связаны с ДНК н выделяются в составе нуклеопротеида. Связь гистон — ДНК электростати­ческая, так как гистоны имеют большой положительный заряд, а цепь ДНК — отрицательный. Гистоноподобные белкн встречаются в составе рибосом цито­плазмы клеток. У одноклеточных организмов некоторые из фракций гистонов отсутствуют. У бактерий нет типичных гистонов, а у вирусов есть гистоно­подобные белки.

Основные функции гистонов — структурная и регуляторная. Структурная функция состоит в том, что гистоны участвуют в стабилизации простран­ственной структуры ДНК, а следовательно, хроматина и хромосом. Четыре фракции гистонов, за исключением Н,, составляют основу нуклеосом, являю­щихся структурными единицами хроматина; фракция Н, заполняет фрагменты ДНК между нуклеосомами. Регуляторная функция заключается в способности блокировать передачу генетической информации от ДНК к РНК.

Протамины — своеобразные биологические заменители гистонов, но ка­чественно отличающиеся от них аминокислотным составом и структурой. Это самые низкомолекулярные белкн (М. 4000—32 000), они обладают резко выраженными основными свойствами из-за большого содержания аргинина (до 80%). Как н гистоны, протамины — поликатнонные белки; они связывают­ся с ДНК в хроматине спермиев. Замена гистонов на протамины в хроматине спермиев наблюдается не у всех животных. Наиболее типично присутствие протаминов в составе нуклеопротамина в сперматозоидах рыб (в моло­ках). Отдельные протамнны получили свое название по источнику получе­ния.

Сальмин — протамин из молоки лосося; клупеин — из икры сельди; труттин — из молоки форели; скумбрин — из молокн скумбрии.

Протамнны делают компактной ДНК сперматозоидов, т. е. выполняют, как и гистоны, структурную функцию. Однако они, по-видимому, не выпол­няют регуляторных функций, поэтому и присутствуют в клетках, не способных к делению. Возможно, этим и объясняется биологическая замена в некоторых клетках гнстонов на протамнны.

Проламнны — группа растительных белков, содержащаяся в клейковине семян злаковых растений. Для проламинов характерна нерастворимость в воде, солевых растворах, кислотах и щелочах. Выделяют их экстракцией 70°-ным этанолом. Этот крайний случай растворимости связан, очевидно, с наличием у них неполярных аминокислот и пролина. Проламины получили названия по источнику выделения: глиадины — из зерна пшеницы и ржи; гордеины — из ячменя; авенины — из овса; зеин — из кукурузы и т. д.

Глютелкны — тоже растительные белки, нерастворимые в воде, растворах солей и этаноле. Они растворимы в слабых щелочах, очевидно, потому, что в них значительно больше, чем в проламинах, содержится аргинина и меньше пролина.

Альбумины и глобулины — групповое название белков, высаливающихся при разном насыщении нейтральными солями (сульфатом аммония или натрия), При 50%-ном насыщении раствора соли выпадают в осадок глобу­лины, а при полном (100%-ном) насыщении — альбумины. Альбумины и глобулины содержатся в плазме кровн, в клетках и биологических жид­костях организма. Каждая нз этих двух групп белков настолько разно­родна, что среди них имеются белки с самыми разнообразными функ­циями.