Получение делеций и вставок

Делецией называют потерю части нуклеотидов в геноме организма. Такой вид мутаций удобнее всего использовать для локализации (картирования) функционально значимых участков генов и кодируемых этими генами белков. Действительно, последовательное удаление все новых и новых участков ДНК на границах генов с помощью делеций оказалось исключительно плодотворным в обнаружении регуляторных элементов генов, исследовании их структурно-функциональных особенностей, взаимного расположения и влияния друг на друга. Простой и эффективный метод получения делеций любого размера разработан с использованием экзонуклеазы Bal31 для удаления нуклеотидов в окрестностях сайтов рестрикции (рис. II.16).

Рис. II.16. Получение делеций с помощью нуклеазы Bal31

Ген, клонированный в плазмиде, расщепляют по уникальному сайту рестрикции и образовавшиеся линейные молекулы ДНК инкубируют в присутствии экзонуклеазы Bal31. При этом экзонуклеаза последовательно удаляет нуклеотиды с обоих концов ДНК, причем количество удаляемых нуклеотидов прямо пропорционально времени инкубации ДНК с нуклеазой, а также зависит от температуры инкубации и концентрации фермента. В результате подобного действия образуется набор фрагментов ДНК разной длины, содержащих делеции различных размеров по обе стороны выбранного сайта рестрикции. К " тупым" концам таких молекул ДНК с помощью ДНК-лигазы присоединяют двухцепочечные олигонуклеотидные линкеры, содержащие уникальный (часто исходный) сайт рестрикции, обрабатывают соответствующей рестриктазой, замыкают молекулы в кольцо посредством лигирования и затем вводят их в бактериальные клетки. Точное картирование концов делеций осуществляют секвенированием соответствующих участков ДНК мутантных плазмид. В результате получают набор делеций разного размера, положение которых в исследуемом фрагменте ДНК строго локализовано.

Небольшие делеции в окрестностях сайтов рестрикции можно получать быстрее удалением " липких" концов линеаризованной плазмидной ДНК после рестрикции с последующим замыканием линейной ДНК в кольцо лигированием по образовавшимся " тупым" концам. В этом случае размер делеции соответствует размеру одноцепочечных " липких" концов в сайтах рестрикции. Кроме того, такой метод допускает простую проверку наличия мутаций в требуемом участке ДНК, так как в результате мутации происходит потеря уникального сайта рестрикции.

Для получения вставок коротких или протяженных последовательностей нуклеотидов в исследуемые участки клонируемых генов также разработаны эффективные и надежные методы. В простейшем случае такая задача решается путем расщепления исследуемого гена рестриктазой по уникальному сайту рестрикции и встраивания по этому сайту фрагмента природной ДНК или синтетического двухцепочечного олигонуклеотида, который фланкирован соответствующими " липкими" концами. Лигирование может проводиться и по " тупым" концам. В таком случае последовательности нуклеотидов на концах вставки уже не имеют существенного значения для встраивания этого фрагмента по сайту рестрикции.

Для создания множественных вставок коротких или протяженных последовательностей нуклеотидов в исследуемых участках ДНК в основном используют два подхода. В первом случае с помощью панкреатической ДНКазы в низких концентрациях в присутствии ионов Mn²⁺ вносят случайным образом один двухцепочечный разрыв в каждую векторную плазмиду, содержащую клонированный ген. К концам образовавшихся линейных молекул ДНК присоединяют с помощью ДНК-лигазы синтетические олигонуклеотидные линкеры, содержащие сайт рестрикции, который отсутствует в исследуемой плазмиде. Образовавшиеся линейные молекулы ДНК с линкерами обрабатывают рестриктазой, узнающей сайт рестрикции линкера, что приводит к образованию " липких" концов, и замыкают в кольцо с помощью ДНК-лигазы. В итоге кольцевые молекулы ДНК содержат исследуемый клонированный ген, в котором имеется по одной вставке локализованных случайным образом (в соответствии с расположением исходных двухцепочечных разрывов) олигонуклеотидных линкеров. Во втором случае статистические разрывы в двухцепочечной ДНК получают путем частичного (неполного) гидролиза мелкощепящими рестриктазами, которые узнают сайт рестрикции длиной в 4 нуклеотида. Метод получения вставок с использованием синтетических олигонуклеотидных линкеров получил название сканирования линкером.