Список скорочень

Гебури Мирослава Петровича

Науковий керівник від кафедри

доцент, к.б.н. Давиденко А. В.

Робота виконана в НДЛ " Фармакології та експериментальної патології" ННЦ " Інституту біології" Київського національного університету імені Тараса Шевченка під керівництвом с.н.с., к.б.н. Толстанової Ганни Миколаївни

Оцінка захисту роботи

___________________________________

Київ – 2011

ЗМІСТ

СПИСОК СКОРОЧЕНЬ.............................................................................................3

ВСТУП…………..………………………………………………...........………….4

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

РОЗДІЛ 1. Антибіотики цефалоспоринового ряду……....…........………...….6

1.1. Класифікація цефалоспоринів.........................................................9

1.2. Характеристика біологічної активності цефтріаксону...............10

РОЗДІЛ 2. Антибіотик асоційована діарея та механізми її розвитку.............13

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА

РОЗДІЛ 3. Матеріали та методи досліджень........................................................17

3.1. Матеріали..........................................................................................17

3.2. Лабораторні тварини........................................................................17

3.3. Схема проведення експерименту................................................17

3.4.Моніторинг клінічних параметрів стану щурів..........................18

3.5. Отримання гомогенату слизової оболонки................................18

3.6. Визначення концентрації протеїнів методом Лоурі....................19

3.7.1. Визначення дієнових кон’югатів ненасичених жирних кислот..19

3. 7.2. Визначення вмісту ТБК-активних продуктів...............................20

3.7.3. Визначення активності каталази....................................................20

3.7.4. Визначення активності СОД..........................................................22

3.8.Статистична обробка даних...............................................................24

РОЗДІЛ 4. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ............................25

4.1. Моніторинг клінічного стану щурів на фоні 5-ти добового та 14-ти добового введення цефтріаксону..........................................................................................23

4.2. Дослідження активності СОД в слизовій оболонці ТК щурів після 5-ти та 14-ти добового введення цефтріаксону......................................................23

4.3. Дослідження активності каталази на фоні 5-ти добового та 14-ти добового введення цефтріаксону....................................................................................27

4.4. Дослідження вмісту МДА на фоні 5-ти добового та 14-ти добового введення цефтріаксону....................................................................................................29

4.5. Дослідження вмісту дієнових кон'югатів на фоні 5-ти добового та 14-ти добового введення цефтріаксону................................................................31

ВИСНОВКИ …………………………………………………….….….................33

СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ ………………………….....….…........35

СПИСОК СКОРОЧЕНЬ

РВР - penicillin-binding proteins

ААД - антибіотик асоційована діарея

КЛЖК - коротколанцюгові жирні кислоти

СОД - супероксиддесмутаза

ПОЛ - перекисне окислення ліпідівк

ТК - товста кишка
ВСТУП

Антибактеріальна терапія займає друге місце після лікувань серцево-судинними препаратами у хворих всіх вікових категорій. Часто від ефективності та своєчасності цієї терапії залежить життя пацієнта. На жаль, окрім переваг антибактеріальна терапія має і побічні ефекти. Найбільш поширеними побічними реакціями, які пов’язані із застосуванням антибактеріальних препаратів, є зміни з боку шлунково-кишкового такту, які спостерігаються у 3-53 % хворих. Ці зміни порушують самопочуття хворого, продовжуючи період непрацездатності на термін від 5 до 14 днів.

Дуже часто, виснажлива діарея - це саме та ціна, яку ми повинні платити за ефективність антибіотиків. Антибіотик-асоційована діарея – це три чи більше епізодів неоформлених випорожнень протягом двох та більше днів, які з’явилися на фоні застосування антибіотиків чи протягом 8 тижнів після їх відміни.

За даними літератури розвиток діареї часто асоціюється з порушенням регуляторних механізмів антиоксидантного захисту. Показано, що лактоза-асоційована діарея у 100% випадків пов’язана зі змінами концентрацій малонового диальдегіду та показниками активності супероксиддисмутази, які у 8-10 разів були вищими за такі у тварин без діареї. Причому, їх рівень позитивно корелював з тяжкістю перебігу діареї.

Запальний процес підтримується процесами перекисного окислення. Важливий чинник запалення – це утворення молекул активних форм кисню, що вивільняються макрофагами і нейтрофілами в ході запальної реакції. У позаклітинному матриксі вони усувають пошкоджені клітини і збудників інфекцій створюючи, таким чином, передумови для відновних процесів. Всередині клітини вони індукують редокс - сенсетивні сигнали і сприяють утворенню запальних медіаторів. Молекули активних форм кисню індукують і підсилюють запалення, набряк, інфільтрацію лейкоцитами, утворення слизу [1].

Якщо продукція вільних радикалів перевершує здатність антиоксидантної системи організму до їх утилізації, то вільні радикали шкодять здоровим тканинам і посилюють запалення [2]. Активація запалення у свою чергу вивільняє активні форми кисню, циклізуючи тим самим дані процеси.

Причиною підвищеної продукції вільних радикалів є не лише запалення, але і екзогенні чинники. Незалежно від екзогенної або ендогенної природи, вільні радикали є причиною оксидативного стресу.

Антибіотики цефалоспоринового ряду відносяться до групи найбільш широко вживаних препаратів. За даними літератури, прийом антибіотиків даного ряду пов'язують з розвитком ААД у 4-9 % випадків [3]. Взаємозв’язок між розвитком діареї та порушенням системи антиоксидантного захисту не встановлений.

Тому, метою нашої роботи стало дослідження оксидантно-антиоксидантної системи слизової оболонки товстої кишки щурів під впливом антибіотика цефтріаксону.

Виходячи з мети перед нами стояли наступні завдання:

1. Моніторинг клінічного стану щурів на фоні 5-ти добового та 14-ти добового введення цефтріаксону.

2. Дослідження активності СОД в слизовій оболонці ТК щурів після 5-ти та 14-ти добового введення цефтріаксону.

3. Дослідження активності каталази в слизовій оболонці ТК щурів після 5-ти та 14-ти добового введення цефтріаксону.

4. Дослідження вмісту МДА в слизовій оболонці ТК щурів після 5-ти та 14-ти добового введення цефтріаксону.

5. Дослідження вмісту дієнових кон'югатів в слизовій оболонці ТК щурів після 5-ти та 14-ти добового введення цефтріаксону.

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

РОЗДІЛ 1

АНТИБІОТИКИ ЦЕФАЛОСПОРИНОВОГО РЯДУ

1.1. Загальні відомості та представники

Створення і впровадження в клінічну практику антибіотиків класу цефалоспоринів є, безумовно, однією з найважливіших подій в історії хіміотерапії бактеріальних інфекцій. На даний час, очевидно, що за спектром антибактеріальної дії, фармакокінетики, безпеки та ін., цефалоспорини перевершують антибіотики багатьох інших класів, чим і пояснюється їх статус найбільш широко вживаних антибіотиків антибактеріальної дії в багатьох країнах світу.

Народження цефалоспоринів справедливо пов'язують з роботами G. Brotzu, що передбачив на початку 40-х років, що періодичне самоочищення стічних вод в Сардінії може бути обумовлене активністю особливих мікроорганізмів, що пригнічують ріст бактеріальної флори. У 1945 р. йому вдалося виділити гриб Cephalosporium acremonium (пізніше названий Acremonium chrysogenum), що володіє вираженою антибактеріальною активністю по відношенню до грам-позитивних і грам-негативних мікроорганізмів.

Наступним етапом було детальне вивчення С. acremonium робочими групами H. Florey і E.P. Аbraham (з 1955 по 1962 р.). З продуктів обміну речовин цього гриба вдалося виділити бактерицидну субстанцію - цефалоспорин С, що стала вихідною речовиною для синтезу 7-аміноцефалоспоринової кислоти - структурної основи цефалоспоринів [4].

У 1962 р. в клінічну практику був введений перший антибіотик класу цефалоспоринів - цефалорідин, проте широка клінічна практика цефалоспоринів почалася лише в кінці 70-х років. В даний час налічується більше 50 антибіотиків цефалоспоринового ряду.

Рис.1.1. " Дерево" цефалоспоринів

Цефалоспорини представляють собою біциклічні з'єднання, що складаються з бета-лактамного і дигідротіазинового кілець. Обидва кільця входять до складу 7-аміноцефалоспоранової кислоти (7-АЦК) - загальне ядро молекули цефалоспоринів. При цьому модифікація хімічної структури 7-АЦК супроводжується істотними змінами властивостей (антибактеріальної активності, параметрів фармакокінетики та ін.) (рис. 1.2.).

Рис.1.2. Цефалоспорини: зв'язок між хімічною структурою і ефектом

Антибактеріальна активність цефалоспоринів, як і інших бета-лактамних антибіотиків, принаймні частково, обумовлена гальмуванням синтезу пептидоглікану - структурної основи мікробної стінки. Пептидоглікани є довгими полісахаридними ланцюгами зі своєрідною сітчастою просторовою конформацією, в яких чергуються залишки N-ацетилглюкозаміна (NAG) і N-ацетилмурамінової кислоти (NAM). NAG- і NАМ-пентапептидні залишки пептидогліканів що синтезуються в цитоплазмі мікробної клітини і транспортуються через цитоплазматичну мембрану. Далі ці залишки вбудовуються в існуючу пептидогліканову мережу (в процесі росту і ділення клітини) за участю різних ензимів - транспептидаз, карбоксипептидази, ендопептидаз. Власне ці ензими, що знаходяться в цитоплазматичній мембрані, є місцем реалізації антибактеріальної активності (мішенями) бета-лактамних антибіотиків, у тому числі цефалоспоринів; вони отримали назву пеніцилін зв'язувальні протеїни (penicillin-binding proteins - РВР). В результаті утворення " тривалого" ковалентного зв'язку бета-лактамного антибіотика і РВР останні інактивуються. При цьому ефект бета-лактамного антибіотика, що призначається, залежить від того, які РВР інактивуються і яку роль вони відіграють в синтезі пептидогліканів і виживанні мікробної клітини. Важливо також підкреслити, що бактерицидний ефект цефалоспоринів реалізується лише в процесі росту і розмноження мікроорганізмів, тоді як клітини у стані " спокою" невразливі для дії антибіотиків [4, 5].

1.2 Класифікація цефалоспоринів

Найбільш вдалою є класифікація цефалоспоринів, в якій врахований спектр антимікробної активності препаратів (таблиця. 1.1.). При цьому в кожному поколінні цефалоспоринів виділяють препарат-прототип, властивості якого використовують при створенні нових сполук: І покоління - цефазолін, ІІ - цефуроксим, ІІІ - цефотаксим, ІV - цефепім.

Таблиця 1.1.

Порівняльна характеристика антимікробної активності цефалоспоринів

Цефалоспорини 1-го покоління характеризуються відносно вузьким спектром антимікробної дії, переважно відносно грампозитивних коків. Цефалоспорини 2-го покоління демонструють варіабельну активність відносно грампозитивних коків і більш виражена дія проти грамнегативних бактерій. Цефалоспорини, що мають виражену бактерицидну дію на грамнегативні мікроорганізми, об'єднані в групу цефалоспоринів 3-го покоління; частина з них характеризується обмеженою активністю відносно грампозитивних коків, особливо метіцилінчутливих штамів S. aureus. Цефепім і цефпіром (4-е покоління цефалоспоринів) демонструють найбільш широкий спектр антимікробної активності, що включає грампозитивні коки і грамнегативні бактерії (більшість представників сімейства Enterobacteriaceae, P. aeruginosa) [6].

1.3 Біологічна активность цефтріаксону

Одним з представників цефалоспоринів ІІІ-покоління є цефтріаксон (Хімічна назва: [6r-[6 альфа, 7 бета(Z)]]-7-[[(2-Аміно-4-тіазоліл)(метоксиіміно)ацетил]аміно]-8-оксо-3-[[(1, 2, 5, 6-тетрагідро-2-метіл-5, 6-діоксо-1, 2, 4-тріазін-3-іл)тіо] мотив ]-5-тіа-1-азабіцикло[4.2.0]окт-2-ен-2-карбоновая кислота (і у вигляді динатрієвой солі)) рис.1.3.

Рис.1.3.Структура молекули цифтріаксону

Цефтріаксон має широкий спектр антимікробної активності, та відрізняється найкращими фармакокінетичними показниками і найтривалішим періодом напіввиведення серед відомих цефалоспоринів III покоління. Це дозволяє підтримувати його терапевтичні концентрації в крові, тканинах і біологічних рідинах впродовж 24 годин після однократної ін'єкції [7, 8]. Антибіотик володіє стабільністю по відношенню до β - лактамаз і ефективно проникає через стінку грамнегативних мікроорганізмів. В клінічній практиці цефтріаксон застосовується при хірургічних втручаннях (29% випадків) та для лікування інфекцій респіраторного тракту (16% випадків) [8, 9]. У зв'язку з його високими фармакокінетичними показниками препарат використовують не лише в умовах стаціонару, а і в амбулаторній практиці.

Після внутрішньовенного введення 0, 5 і 1, 5 г цефтріаксону максимальна концентрація в крові рівна відповідно 150 і 290 мг/л. Рівень зв'язування з білками плазми прямо залежить від дози препарату. Період напіввиведення препарату складає 6-9 год, який триває довше при печінковій і нирковій недостатності, у новонароджених і людей похилого віку до 12-15 год. Препарат виводиться з сечею в незміненому вигляді (до 45-60%) і з жовчю. Препарат добре проникає через гематоенцифалічний бар'єр, та здатен накопичуватися в бактерицидних концентраціях у мокроті, плевральній рідині, жовчному міхурі, нирках, матці, придатках та кістках. Якщо м'яка мозкова оболонка інтактна, то концентрація цефтріаксону в цереброспинальній рідині відносно невелика, проте при розвитку менінгіту вона значно зростає. Вміст лікарської речовини в цереброспинальній рідині при цьому досягає 7-11% від його концентрації в сироватці крові, що в 5-10 разів перевершує мінімальну ефективну концентрацію, для пригнічення збудників гнійного менінгіту.

Антибактеріальна дія цефтріаксону базується на блокуванні синтезу клітинної стінки мікробів. Цей антибіотик ацетилює мембранозв'язані транспептидази, при цьому пригнічується перехресне зшивання пептидогліканів мікроорганізмів. Це приводить до того, що клітинні стінки мікроорганізмів стають неміцними і нестійкими до подразників.

РОЗДІЛ 2

АНТИБІОТИК АСОЦІЙОВАНА ДІАРЕЯ ТА МЕХАНІЗМИ ЇЇ РОЗВИТКУ

Діарея – відносно частий (близько 7% від загального числа) побічний ефект дії ліків. Описано більше 700 препаратів, здатних провокувати послаблення випорожнення; найбільш високий ризик розвитку діареї при прийомі антибактеріальних препаратів, магнійвмісних антацидів, препаратів, що містять лактозу і сорбітол, нестероїдних протизапальних засобів, препаратів простагландинів, колхіцину, протипухлинних засобів, антиаритмічних, інгібіторів ліпази і холінергичних засобів [10, 11, 12].

Антибактеріальні засоби «винні» в чверті випадків діареї, що індукується ліками. Антибіотик асоційована діарея (ААД) варіює від субклітинної, що протікає в легкій формі, до тяжких випадків у формі псевдомембранозного коліту.

Патогенетичні механізми порушення випорожнення при діареї викликаній ліками включають осмотичний (внаслідок накопичення в просвіті кишечника вуглеводів, що не піддалися повноцінному метаболізму), секреторний, дискінетичній (прискорення кишкового транзиту), ексудативний. Часто в основі розвитку діареї лежать два чи більше патогенетичних чинники. При тяжкому протіканні може розвиватися ентеропатія з втратою протеїнів, а також синдром мальабсорбції [13, 14, 15, 16].

За клінічними проявами виділяють гостру, таку, що розвивається в перші декілька днів вживання препарату, і хронічну – тривалістю 3–4 тижні і більше. Остання може з'явитися через відносно тривалий період після початку вживання медикаменту, інколи навіть через декілька місяців і років, у такому разі встановити зв'язок з лікуванням, що проводилось, буває вельми важко. Як гостра, так і хронічна діарея можуть мати різну тяжкість протікання [17].

Розвиток ААД пов'язують з порушенням концентраці КЛЖК. При прийомі антибактеріальних засобів гине частина представників нормальної мікрофлори, що має основне значення для метаболізму вуглеводів і утворення жирних кислот. У ряді випадків наростання популяції умовно–патогенних мікробів, таких як Clostridium perfringens, також є причиною у появу діареї. Як правило, розвиток діареї провокують антибіотики широкого спектру дії, що володіють здатністю пригнічувати ріст анаеробної флори.

Вірогідність розвитку ААД на фоні лікування різними антибіотиками варіює від 5 до 25%. ААД розділяють на: 1) - просту (ідіопатичну) обумовлену порушенням метаболізму КЛЖК і активацією Clostridium рerfringens. Проста ААД протікає відносно легко, без ознак системного запалення; 2) зумовлену інфекцією Clostridium difficile, цей тип ААД часто ускладнюється псевдомембранозним колітом, і частими рецидивами. Серед всіх випадків ААД частота псевдомембранозного коліту, обумовленого інфекцією Clostridium difficile, може досягати 10–20% (найбільш високий ризик спостерігається у пацієнтів, що знаходяться у важкому стані. КЛЖК є кінцевими продуктами ферментації вуглеводів анаеробними бактеріями. Вони утворюються переважно в товстій кишці, і їх регуляція– одна з найважливіших функцій цього відділу травного тракту. КЛЖК у людини представлені переважно ацетатом, пропіонатом і бутиратом. Ці три органічні кислоти складають приблизно 80% аніонів в просвіті товстої кишки і виробляються у відносно постійному молярному співвідношенні – 60: 25: 15. КЛЖК легко абсорбуються слизовою оболонкою кишечнику, слугують найважливішим джерелом енергії для кишкового епітелію, а також стимулюють абсорбцію натрію і води. Причини розвитку простої ААД отримали пояснення ще в початку 1990–х рр. Але якщо раніше цей процес імовірно пов'язували з наростанням популяції кандід і інших умовно – патогенних мікробів, то згодом з'ясувалося, що основну роль грає порушення переробки вуглеводів бактеріями – представниками основної популяції. Особливості ферментації вуглеводів в товстій кишці вивчалися у пацієнтів, що приймали антибіотики; при цьому проводилося порівняння підгрупи з розвинутою ААД з підгрупою без порушень випорожнення і групою контролю, що не приймали ліків. У хворих з розвинутою ААД відзначалось істотне зниження продукції КЛЖК [18-22].

ААД діарею найчастіше викликають лінкоміцин, ампіцилін, кліндаміцин, бензилпеніциллін, цефалоспорини, тетрациклін, еритроміцин. Спосіб введення антибіотика не має великого значення. При вживанні окрім ерадикації мікроорганізмів антибіотик впливає на слизову оболонку тонкої кишки. При парентеральному введенні антибіотики впливають на біоценоз кишечнику, виділяючись із слиною, жовчю, секретами тонкої і товстої кишок. Симптоми ААД у більшості хворих зазвичай з'являються під час лікування, а в 30% — в межах 7–10 днів після його припинення.