Значение иммунологических методов диагностики

Диагностически значимыми показателями у пациентов с РС являются (Хайер Д., 1997):

1 - повышение уровня g-глобулинов в спинно-мозговой жидкости (СМЖ) (у 75% больных);

2 – выявление олигоклональных IgG в СМЖ (у 85-95% больных) уже на ранней стадии заболевания;

3- повышенное содержание в СМЖ основного белка миелина, что может служить признаком обострения процесса; значения этого показателя более 9 нг/мл свидетельствуют об активной демиелинизации.

Для оценки характера течения РС используются менее инвазивные и более доступные методы (материалом для исследования является периферическая кровь):

· иммунофлюоресцентный метод определения субпопуляций Т- и В-лимфоцитов с помощью наборов моноклональных антител (МАТ) CD3⁺, CD4⁺, CD8⁺, CD22⁺;

· метод оценки пролиферации лимфоцитов: спонтанной и под действием Т- и В-клеточных митогенов (ФГА, Кон-А, PWМ) - реакция бласттрансформации лимфоцитов;

· метод определения активности супрессорных лимфоцитов: спонтанной и Кон-А индуцированной;

· метод определения чувствительности иммунокомпетентных клеток к нейроспецифическим антигенам - белку S-100, антигену нейрональных мембран, основному белку миелина и др. - реакция торможения адгезии лейкоцитов;

· метод определения кислородзависимой бактерицидности фагоцитирующих клеток периферической крови в тесте восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест);

· метод радиальной иммунодиффузии в геле для определения количества иммуноглобулинов классов A, G, M.

Дифференцировочные антигены Т-лимфоцитов выделяют с помощью метода проточной цитометрии, непрямой иммунофлюоресценции, лимфотоксического теста. Для выполнения этих методов необходимы моноклональные антитела к дифференцировочным антигенам Т-лимфоцитов. С помощью поверхностных антигенных маркеров можно определить популяцию и субпопуляцию клеток, стадию их дифференцировки и активации. Наиболее доступный метод иммунофлюоресценции основан на способности моноантител фиксироваться на поверхности жизнеспособных клеток и позволяет выявить специфические антигенные детерминанты: CD3, CD4, CD8 и др. после дополнительной обработки лимфоцитов антииммуноглобулинами, меченными ФИТЦ.

Реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) позволяет определить способность этих клеток отвечать трансформацией в бласты в присутствии митогенов: Т-лимфоцитов – в присутствии ФГА и Кон-А, В-лимфоцитов – в присутствии митогена лаконоса. Бласттрансформация наблюдается в тканях в результате антигенной стимуляции, образующиеся бласты способны к дальнейшей пролиферации и дифференцировке.

Определение количества В-лимфоцитов. В основе методик лежит тот факт, что на поверхности В-лимфоцитов имеются рецепторы для Fс-фрагмента иммуноглобулинов, для третьего компонента комплемента (С3), для мышиных эритроцитов и иммуноглобулиновые детерминанты. Наиболее значимыми поверхностными маркерами В-лимфоцитов являются рецепторы CD19, CD20, CD22, определяемые с помощью МАТ методом проточной цитометрии. Определение количества В-клеток и степени их зрелости важно при первичных гуморальных иммунодефицитах, когда необходимо осуществить дифференциацию между агаммоглобулинемией с В- и без В-клеток.

Количественное определение иммуноглобулинов. Наибольшее распространение получил метод Manchini et al. (1970), в основе которого используется радиальная иммунодиффузия в геле, содержащем моноспецифические сыворотки против иммуноглобулинов классов А, G, М. Уровни иммуноглобулинов рассчитывают после построения калибровочной кривой, выражающей зависимость между уровнем иммуноглобулинов и диаметром колец преципитации и выражают в мг/мл.

Определение уровня циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в сыворотке крови. ЦИК являются результатом компенсаторной реакции антителообразования, направленной на элиминацию антигенов. Образование растворимых комплексов АГ-АТ провоцирует ряд патологических состояний: ревматизм, системная красная волчанка, артрит и др. Комплексы АГ-АТ-С вызывают повреждения тканей различной степени тяжести: от локальных до некрозо-геморрагических. Определение комплексов производят методом спектрофотометрии сыворотки крови, обработанной полиэтиленгликолем. Метод прост, доступен, в норме уровень ЦИК составляет 90-95%, при увеличении их количества процент пропускания снижается.

Тест восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест) основан на способности восстановления поглощенного фагоцитом растворимого красителя нитросинего тетразолия в нерастворимый диформазан под влиянием супероксиданиона, образующегося в НАДФ-Н-оксидазной реакции. Наиболее доступен и прост цитохимический вариант теста (по Маянскому А.Н., 1993). Другим методом оценки респираторного взрыва в фагоцитах является измерение спонтанной и индуцированной хемолюминесценции. НСТ-тест может быть также измерен с помощью проточного цитометра. Показатели НСТ-теста значительно повышаются в начальном периоде заболевания при многих острых бактериальных инфекциях; при подостром и хроническом течении они чаще бывают снижены.

Реакция торможения адгезии лейкоцитов (РТАЛ) основана на прекращении адгезии сенсибилизированных лейкоцитов к пластиковым поверхностям в присутствии специфических антигенов. Индекс ангезии (ИА) рассчитывается как отношение среднего числа прилипших клеток в опытных лунках (содержащих раствор антигена) к таковому в контрольных лунках. Индекс менее 0, 7 расценивается как положительная реакция, индекс более 1, 33 – как слабо положительная.

Определение активности естественных киллеров (NK) проводят с помощью капиллярного теста, информативность которого возрастает при одновременном учете количества лимфоцитов с CD16 маркером. Принцип метода заключается в сокультивировании исследуемых клеток и клеток-мишеней в плоском капилляре с трипановым синим. После инкубации учитываются окрашенные клетки-мишени, что соответствует % спонтанной цитотоксичности. Показатель активности NK-клеток у доноров составляет 15%, хотя коэффициент вариации колеблется от 10 до 23%.

В систему определения иммунного статуса может быть включено определение HLA-антигенов лимфоцитов, поскольку многие из них отражают риск развития тех или иных заболеваний. Определение производят с помощью МАТ методом проточной цитометрии или иммунофлюоресценции. Для клинической иммунологии имеет значение связь ряда антигенных маркеров человека с развитием тех или иных заболеваний. Антигенные маркеры рассматриваются как показатели риска развития или неблагоприятного течения заболевания. Выявлено, что здоровые лица, обладающие HLA-антигеном DR3, отличаются пониженной активностью клеток макрофагальной системы: сниженной способностью к продукции интерлейкина-1, замедленной деградацией антигенов, замедленным выведением из организма комплексов АГ-АТ, снижением способности лимфоцитов к стимуляции митогенами.

Объектом иммунологического исследования могут служить периферическая кровь, ликвор, слюна и другие биологические жидкости.

Таблица 10. Основные показатели иммунного статуса у здоровых лиц (М±m)