Определение биомассы микроорганизмов.

Очень часто требуется знать не число клеток, а биомассу изучаемых микроорганизмов, содержащихся в определенном объеме культуральной среде. Биомассу микроорганизмов определяют весовыми, химическими и оптическими методами.

Определение биомассы весовым методом.

Определение биомассы весовым методом возможно, главным образом, только при культивировании микроорганизмов в жидких питательных средах. Иногда этим способом определяют биомассу микроорганизмов, выращенных на плотной среде. Однако в этом случае микроорганизмы должны быть предварительно переведены в суспензию тщательным смывом всей культуры с поверхности среды физиологическим раствором или дистиллированной водой.

Определение веса биомассы микроорганизмов состоит из трех последовательных операций: доведения веса центрифужных пробирок (бюксов) или фильтров до постоянного значения, отделения клеток микроорганизмов культуральной жидкости и определения веса полученной биомассы. Чаще всего определяют вес сухой биомассы, хотя иногда можно ограничиться определением веса сырой биомассы. В последнем случае первый этап отпадает; достаточно только взвесить центрифужную пробирку (бюкс или фильтр), но не доводить ее вес до постоянного значения. Вес биомассы обычно выражают в граммах или миллиграммах на литр среды.

Доведение веса центрифужных пробирок до постоянного значения осуществляется высушиванием в сушильном шкафу в течение 1-2 часов при температуре 80-85 С и 90-100 С соответственно. Взвешивание осуществляют на аналитических весах с точностью 0, 0001г несколько раз до постоянного значения (±0, 0001г). Отделение клеток микроорганизмов от культуральной жидкости возможно центрифугированием или фильтрованием. Центрифугированием отделяют обычно бактериальные или дрожжевые клетки. Для этого в центрифужную пробирку наливают точно отмеренный объем тщательно перемешанной культуры, который определяется плотностью исходной суспензии и чаще всего колеблется от 5 до 20 мл. Время центрифугирования и число оборотов зависят от размеров клеток. Чем меньше размеры клеток, тем больше требуется оборотов и тем продолжительнее должно быть время центрифугирования. Чище всего центрифугируют 10-30 мин при 5-15 тыс.оборотов в мин. После центрифугирования надосадочную жидкость осторожно сливают, осадок 1-2 раза промывают слегка подкисленной дистиллированной водой (1 мл концентрированной НСl на литр воды) и снова центрифугируют при том же числе оборотов. Сливать надосадочную жидкость или промывание воды рекомендуется тотчас же после остановки центрифуги. Осадок оставляют в центрифужной пробирке или, количественно с помощью дистиллированной воды переносят в стеклянный бюкс, вес которого предварительно доведен до постоянного значения.

Фильтрование можно проводить, используя обеззоленные, мембранные или стеклянные фильтры. Мицелий актиномицетов или плесневых грибов отделяют от культуральной жидкости с помощью бумажных фильтров. Бумажный фильтр помещают в обычную стеклянную воронку и фильтруют через него, как и при центрифугировании, точно отмеренный объём культуры (5-10 мл).

Определение веса биомассы: для измерения веса сухой биомассы центрифужную пробирку или фильтр с осадком клеток микроорганизмов высушивают в сушильном шкафу, обычно при 105 С до постоянного веса и взвешивают. Вес сухой биомассы определяют по формуле:

,

где М – вес сухой биомассы в г/л, А – вес центрифужной пробирки с осадком в г, В – вес центрифужной пробирки без осадка в г, V - объём культуральной жидкости, взятый для центрифугирования в мл.

Точность метода определяется полнотой отмывания осадка клеток от солей среды и тщательностью взвешивания.

Определение биомассы химическим методам.

Химические методы определения биомассы сводятся к количественной оценке веществ, содержание которых в клетке отличается относительным постоянством: например, общего или белкового азота.

Общее количество азота обычно определяют по методу Кьельдаля. Принцип метода заключается в озолении органических веществ клеток с помощью концентрированной серной кислоты и катализатора. При этом азот, входящий в состав органических соединений, переходит в азот сернокислого аммония. Количественно образовавшегося аммония определяют объёмным титрованием или колориметрически с помощью реактива Несслера.

Количество растворимого в воде белка можно определить по методам Лоури или Брелфорда посе гидролиза клеток 2н NaOH.

Определение биомассы оптическим методом.

Метод основан на изменении интенсивности через суспензию микроорганизмов. Клетки микроорганизмов поглощают и рассеивают свет, причем интенсивность этих процессов от числа клеток и их размеров. Фотоэлектроколориметры (ФЭК и КФК), спектрофотометры (СФ)

Имеряют поглощения, а нефелометры – рассеивание света суспензиями. Составляется калибровочный график зависимости показаний прибора от величины биомассы.

Длину волны для суспензии неокрашенных бактерий выбирают исходя из того, что при малых длинах волн прибор обладает повышенной чувствительностью, следовательно, при малых длинах волн могут измеряться низкие концентрации клеток. Более длинные волны предпочтительны для плотных суспензий и клеток, находящихся в ростовой среде.