Регуляция инициации репликации в эукариотических клетках

В эукариотических клетках существует главный регуляторный механизм, делающий инициацию репликации на каждой ОНР возможной один и только один раз за клеточный цикл. Он назван лицензированием. Каждая ОНР в фазах M/G₁ получает лицензию на однократную репликацию, и клетка обязательно должна пройти митоз, чтобы получить такую лицензию повторно. Механизм лицензирования критически зависит от погрузки в позднем митозе или в фазе G₁ комплекса белков МСМ на ОНР, т.е. от образования предрепликативного комплекса.

Повторная сборка такого комплекса до завершения митоза запрещается несколькими механизмами, в которых важную роль играют протеинкиназы, существенные как раз для прохождения фазы митоза. Ими являются комплекс киназы Cdc28 с циклинами типа В у дрожжей и комплекс киназы Cdk2 с циклинами типов А и Е у высших эукариотов. В клеточном цикле высших эукариотов нестабилен даже комплекс ORC, специфически метящий ОНР. Он дестабилизируется в фазе митоза и повторно образуется только в ранней фазе G₁. Более универсальным является освобождение из комплекса с ORC на ОНР белка Cdc6 (погрузчика белков МСМ), которое происходит в фазы S ещё до начала синтеза ДНК. Свободный белок Cdc6 в фосфорилированной протеинкиназами форме подвергается разушению при участии протеасом у дрожжей, а у высших эукариотов транслоцируется из ядра в цитопазму, где и остается до завершения митоза. Поэтому повторная погрузка комплекса МСМ в фазе S становится невозможной. Однако фосфорилирования Cdc6 недостаточно для строгого контроля инициации репликации: гиперпродукция мутанта белка Cdc6 дрожжей, у которого устранены известные сайты фосфорилирования, не вызывает повторной инициации в том же клеточном цикле. Во время фазы S сами белки МСМ в результате фосфорилирования киназой Cdc7-Dbf4 постепенно освобождаются из хроматина и выходят в цитоплазму у дрожжей. У высших эукариотов освобожденные из репликативного комплекса белки МСМ остаются в ядре во время фазы S. Поэтому для предотвращения реинициации требуется дополнительный механизм, состоящий в исчезновении в фазе S лицензирующего фактора RLF-B. Вновь синтезированный белок RFL-B может войти в ядро только после митоза, во время которого ядерная оболочка становится проницаемой для цитоплазматических белков. Таким образом, по меньшей мере 4 механизма используются эукариотическими клетками для предотвращения повторной сборки предрепликативных комплексов до завершения митоза.

Однократное использование ОНР за клеточный цикл вовсе не означает, что инициация синтеза ДНК на всех ОНР в эукариотической клетке происходит одновременно. Уже давно было установлено, что разные области эукариотических хромосом реплицируются в разные характеристические моменты в фазе S. Одни ОНР активируются для инициации рано, а другие поздно. Рано и поздно запускаемые (early and late firing) ОНР сгруппированы в разных кластерах, которые реплицируются в определенные интервалы времени. Временной порядок запуска ОНР остается в целом инвариантным во время последовательных генераций. Рано реплицирующиеся области хроматина цитологически соответствуют R-полосам, содержащим транскрипционно активные гены домашнего хозяства. Напротив, тканеспецифические гены, не экспрессируемые в данной ткани, присутствуют в поздно реплицирующихся G-полосах. Если же в этой ткани такие гены экспрессируются, то они реплицируются рано. Таким образом, рано реплицирующиеся гены находятся в эухроматине, а поздно реплицирующиеся гены – в гетерохроматине. К поздно реплицирующимся сегментам хроматина относятся также области теломер и центромер, транскрипционно инактивированные Х-хромосомы самок и молчащие копии импринтированных генов.

В определении временного порядка запуска ОНР важную роль играет структура хроматина. Об этом свидетельствуют данные, полученные при искусственном перемещении ОНР ARS в хромосомах дрожжей. Установлено, что при переносе поздно запускаемой ОНР из прителомерной области хромосомы в эухроматиновую область эта ОНР начинает реплицироваться рано. Таким образом, не первичная последовательность ДНК ОНР, а структура хроматина определяет расписание использования ОНР для инициации репликации, хотя известны исключения из этого обшего правила.

Изучение кинетики сборки предрепликативных комплексах на ОНР разного типа у дрожжей in vivo показало, что вербовка комплексов МСМ происходит одновременно на ранних и поздних ОНР. Однако последующие этапы связывания белка Cdc45 и погрузки RPA и ДНК-полимераз наблюдаются во время перехода G₁®S на рано запускаемых ОНР и значительно отсрочены на поздно запускаемых ОНР. Это позволяет предположить, что решающую роль в расписании репликации во время фазы S играет связывание с лицензированными ОНР белка Cdc45, зависящее от его фосфорилирования. В выяснении механизма этого эффекта важную роль сыграли мутанты дрожжей, дефектные по циклинам Clb5 и/или Clb6. Отсутствие одного Clb6 не повлияло на активацию ОНР. Однако у мутантов Clb5 поздно запускаемые ОНР не инициируют репликацию, и контролируемые ими области хромосомы пассивно реплицируются из отдаленных ранних ОНР. Высказано предположение, что Clb6 участвует только в активации ранних ОНР, а Clb5 требуется для координированного во времени запуска ранних и поздних ОНР. Возможно, специфическое фосфорилирование комплексом Cdc28-Cdc5 необходимо для ассоциации Cdc45 и образования предрепликативных комплексов на поздних ОНР.

Однако циклин-зависимые протеинкиназы клеточного цикла не являются единственными факторами, определяющими раннее и позднее использование ОНР у дрожжей. Существенной является и протеинкиназа Rad53 – плеотропный регулятор контрольных точек повреждения ДНК и репликации ДНК в фазах G₁ и S. Мутации в гене RAD53 не только делают клетки более чувствительными к повреждениям ДНК, но и изменяют расписание инициации репликации. Так, у некоторых мутантов rad53 поздние ОНР начинают активироваться более рано в фазе S. Следует отметить, что белок Rad53 физически взаимодействует с Dbf4 и может регулировать активность протеинкиназы Cdc7-Dbf4.

Различная кинетика использования ОНР в одной и той же клетке и возможность обойтись без поздних ОНР за счет активности ранних ОНР помогают понять ещё один аспект регуляции инициации ДНК, характерный для многоклеточных эукариотов. Продолжительность фазы S на разных стадиях развития животных не одинакова: она составляет от нескольких минут в быстро делящихся клетках эмбрионов (на стадии дробления) до нескольких часов в тканях взрослых организмов того же вида. С другой стороны, скорость репликации ДНК в обоих случаях примерно одинакова. Отсюда вытекает логический вывод: для обеспечения репликации генома на разных стадиях развития высшие эукариоты могут использовать разное число потенциальных ОНР, содержащихся в геноме. Для быстрой пролиферации эмбриональных клеток требуется активировать все ОНР, а для медленного роста клеток взрослых тканей можно ограничиться использованием более узкого их подмножества.

ЛИТЕРАТУРА

1. Messer W. Initiation of DNA replication in Escherichia coli // J. Bacteriol., v. 169, 3395-3399, 1987.

2. Georgopoulos C. The E. coli dnaA initiation protein // Trends Biochem. Sci., v. 5, 319-321, 1989.

3. Skarstad K., Boye E. The initiator protein DnaA: evolution, properties and function // Biochim. Biophys. Acta, v. 1217, 111-130, 1994.

4. Messer W., Blaesing F., Majka J. et al. Functional domains of DnaA proteins // Biochimie, v. 81, 819-825, 1999.

5. Messer W., Blaesing F., Jakimowicz D. et al. Bacterial replication initiator DnaA. Rules for DnaA loading and roles of DnaA in origin unwinding and helicase loading // Biochimie, v. 83, 5-12, 2001.

6. Marczynski G.T., Shapiro L. Bacterial chromosome origins of replication // Curr. Opin. Genet. Devel., v. 3, 775-781, 1993

7. Crooke E. Regulation of chromosomal replication in E. coli: sequestration and beyond // Cell., v. 82, 877-880, 1995.

8. Norris V., Fralick J., Danchin A. A SeqA hyperstructure and its interactions direct the replication and sequestration of DNA // Mol. Microbiol., v. 37. 696-702, 2000.

9. Boye E., Lobner-Olesen A., Skarstad K. Limiting replication to once and only once // EMBO Reports, v. 11, 479-483, 2000.

10. Katayama T., Fujimitsu K., Ogawa T. Multiple pathways regulating DnaA function in Escherichia coli: distinct roles for DnaA titration by the datA locus and the regulatory inactivation of DnaA // Biochimie, v. 83, 13-17, 2001.

11. Newlon C.S. Putting it all together: building a prereplicative complex // Cell, v. 91, 717-720, 1997.

12. Takisawa H., Mimura S., Kubota Y. Eukaryotic DNA replication: from pre-replication complex to initiation complex // Curr. Opin. Cell Biol., v. 12, 690-696, 2000.

13. Ritzi M., Knippers R. Initiation of genome replication: assembly and dissembly of replication-competent chromatin // Gene, v. 245, 13-20, 2000.

14. DePamphilis M.L. Origins of DNA replication // In: “DNA Replication in Eukaryotic Cells”, 1996, Cold Spring Harbor Lab Press, Cold Spring Harbor, N.Y., pp. 45-86.

15. DePamphilis M.L. Initiation of DNA replication in eukaryotic chromosomes // J. Cell. Biochem. Suppl., v. 30-31, 8-17, 1998.

16. Bogan J.A., Natale D.A., DePamphilis M.L. Initiation of eukaryotic DNA replication: conservative or liberal // J. Cell. Physiol., v. 184, 139-150, 2000.

17. Bryant J. A ., Moore K., Aves S.J. Origins and complexes // J. Experim. Bot., v. 53, 192-202, 2001.

18. Jares P., Donaldson A., Blow J.J. The Cdc7/Dbf4 protein kinase: target of the S phase checkpoint? // EMBO Reports, v. 11, 319-322, 2000.

19. Masai S., Arai K. Cdc7 kinase complex: a key regulator in the initiation of DNA relication // J. Cell. Physiol., v. 190, 287-296, 2002.

20. Dijkwel P.A., Hamlin J.L. Physical and genetic mapping of mammalian replication origins // Methods: a Comparison to Methods in Enzymol., v. 18, 418-431, 1999.

21. Gilbert D.M. Replication origins in yeast versus metazoa: separation of the haves and the haves nots // Curr. Opin. Genet. Devel., v. 8, 194-199, 1999.

22. Francon P., Maiorano D., Mechali M. Initiation of DNA replication in eukaryotes: questioning the origin // FEBS Lett., v. 452, 87-91, 1999. Chevallier S., Blow J.J. Cell cycle control of replication initiation in eukaryotes // Curr. Opin. Cell. Biol., v. 8, 815-821, 1996.

23. Donaldson A.D., Blow J.J. The regulation of replication origin activation // Cur. Opin. Genet. and Devel., v. 9, 62-68, 1999.

24. Littlewood J. Emerging mechanisms of eukaryotic DNA replication initiation // Curr. Opin. Cell Biol., v. 10, 742-748, 1998.

25. Rowles A., Blow J.J. Chromatin proteins involved in the initiation of DNA replication // Curr. Opin. Genet. Devel., v. 7, 152-157, 1997.

26. Hyrien O., Maric C., Lucas I. Role of nuclear architecture in eukaryotic DNA replication // Biochimie, v. 79, 541-548, 1997.

27. Larkins B.A., Dilkes B.P., Dante R.A., Coelho C.M., Woo Y., Liu Y. Investigating the hows and whys of DNA endoreduplication // J. Experim. Bot., v. 82, 183-192, 2001.