Области начала репликации (ОНР) ARS и комплекс узнавания ОНР (ORC)

У S. cerevisiae были идентифицированы специфические элементы хромосомной ДНК, названные автономно реплицирующимися последовательностями ARS (autonomously replicating sequences). Встраивание этих элементов в кольцевые плазмидные ДНК обеспечивает автономную репликацию плазмид в клетках дрожжей. С использованием метода двумерного гель-электрофореза, позволяющего обнаружить репликативные пузырьки ДНК, было показано, что элементы ARS совпадают с сайтами начала двунаправленной репликации ДНК как в содержащих ARS плазмидах, так и в самих дрожжевых хромосомах. Таким образом, последовательности ARS являются функциональными ОНР хромосомной ДНК S. cerevisiae. Эти свойства дрожжевых ОНР значительно облегчили их изучение.

В 16 хромосомах S. cerevisiae содержатся от 250 до 400 ОНР. Все изученные элементы ARS у дрожжей, имеющие модульную структуру, состоят из доменов А и В и имеют длину 100-150 п.н. (рис. 3.5). Домен А содержит консенсусную последовательность, названную ACS (ARS consensus sequence). Элемент ACS длиной 11 п.н. имеет первичную последовательность (A/T)TTTA(T/C)(A/G)TTT(A/T), являющуюся существенной для инициации репликации. Даже одиночные замены нуклеотидов в ACS могут устранить активность ARS. Тем не менее, некоторые известные ARS, содержащие одну и даже две измененные пары нуклеотидов по сравнению с ACS, являются эффективными ОНР. С другой стороны, не каждая последовательность ACS в геноме проявляет активность ОНР в отсутствие других доменов ARS.

Домен В в ARS состоит из 3 элементов. Ближайший к ACS элемент В1 образует вместе с ACS сайт связывания белкового комплекса узнавания ОНР. Богатый остатками А и Т элемент В2 выполняет функцию элемента расплетания ДНК DUE. Репликация ДНК в прототипной хромосомной ОНР ARS1 инициируется примерно посередине между сегментами В1 и В2. Элемент В3 в некоторых ARS связывает фактор транскрипции Abf1 и играет роль вспомогательного элемента AUX, обеспечивающего оптимальную эффективность инициации репликации. Элементы доменов В в различных элементах ARS у дрожжей гораздо менеее консервативны, чем домен А. Наиболее консервативным из них является элемент В1.

В прототипный элемент ARS1 иногда включают и третий домен С, расположенный по другую сторону от ACS и упакованный в уникально позиционированную нуклеосому. Эта нуклеосома, вероятно, понижает вероятность упаковки смежного сайта ACS в другую нуклеосому, которая могла бы подавить активность ARS1.

C последовательностью ACS и смежным сегментом В1 в дрожжевых ARS на протяжении почти всего клеточного цикла связан белковый комплекс узнавания ori (ORC – origin recognition complex). Общее количество комплексов ORC в одной клетке примерно соответствует числу ARS. Этот комплекс состоит из 6 белков, кодируемых существенными генами ORC1-ORC6. Аналогичные комплексы ORC имеются у всех эукариотов (табл. 4.1). Три субъединицы комплекса (Orc1, Orc4 и Orc5) содержат сайты связывания нуклеотидов, как у ДНК-зависимых АТФаз, и относятся к семейству АТФаз ААА+. Самая большая субъединица Orc1 может гидролизовать АТФ in vitro, но в присутствии ДНК ARS гидролиз АТФ предотвращается. По-видимому, как и в случае белка DnaA, связанный АТФ играет в ORC роль аллостерического эффектора, требующегося для специфической ассоциации с последовательностями ДНК ARS, а гидролиз АТФ идет на более поздних стадиях инициации репликации.

AAATTTCGAAAAATGCT AAGAAATAGGTTAGTACTGAGTAGT

B3

ATTTATTTAAGTATT GTTTGTGCACTTGCCTG CAAGGGCCTTTT

B2

GAAAAGCAAGCAT AAAAGATC TAAACATAAAA TCTGTAAAATAACA

B1 ACS