Фармакомеханическое сопряжение

В некоторых гладких мышцах возбуждающие нейротрансмиттеры и гормоны вызывают сокращение без генерации потенциала действия. Внутриклеточная концентрация ионов кальция в данном случае может повышаться либо путем освобождения Са²⁺ из саркоплазматического ретикулума либо благодаря входу Са²⁺ через депо-управляемые каналы. Такой путь сопряжения называется фармако-механическим сопряжением. Независимо от источников, повышение внутриклеточной концентрации Са²⁺ вызывает сокращение гладкой мышцы [56, 62, 149, 150, 177, 306].

Наиболее важным путем, приводящим к освобождению ионов Са²⁺ из саркоплазматического ретикулума для гладкой мышцы является путь инозитол-1, 4, 5-трифосфата (рис.13) [181, 363].

Существование этого пути было предположено на основании наблюдения, что некоторые внеклеточные агонисты могут приводить к сокращению гладкой мышцы с минимальной деполяризацией и с незначительным Са²⁺ входом. В частности, для таких агонистов, как серотонин или норадреналин было замечено, что наблюдаемое повышение концентрации Са²⁺ в клетке несколько выше, чем если бы оно зависело исключительно от входа Са²⁺. Следовательно, для этих агонистов существует другой, параллельный путь повышения концентрации Са²⁺ в клетке и агонисты вызывают сокращение гладкой мышцы, усиливая образование иозитол-1, 4, 5-трифосфата. Инозитол-1, 4, 5-трифосфат связывается со специфическим рецептором на мембране саркоплазматического ретикулума гладкомышечной клетки. Рецепторы к инозитол-1, 4, 5-трифосфату сами по себе являются лиганд-управляемыми Са²⁺ каналами. Рецептор к инозитол-1, 4, 5-трифосфату (IP₃)- это тетрамер, состоящий из мономеров с молекулярной массой 300-350кДа. В настоящее время обнаружено 3 изоформы, которые отличаются по степени чувствительности к инозитол-1, 4, 5-трифосфату. Процесс открытия Са²⁺канала IP₃ рецептора зависит от концентрации ионов Са²⁺ в саркоплазме, поэтому Са²⁺ считается ко-активатором IP₃-рецептора [307, 186, 363, 346].

Таким образом, активация некоторыми агонистами рецепторов плазматической мембраны может не прямым путем вызывать освобождение Са²⁺ из саркоплазматического ретикулума и стимулировать сокращение гладкой мышцы.

В состав плазматической мембраны входит фосфолипид фосфатидилинозитол. Часть этой мелкой молекулы, содержащая инозитол, находится на внутренней поверхности мембраны. В результате фосфорилирования образуются две молекулы, играющие существенную роль в механизмах внутриклеточной передачи возбуждения: фосфатидилинозитолфосфат и фосфатидилинозитол-4, 5-бифосфат.

Агонисты активируют серпентинные рецепторы, сцепленные с гетеротримерным G-белком, в результате чего стимулируется фосфолипаза С. Этот фермент специфично расщепляет мембранный липид фосфоинозитол-4, 5-бифосфат с образованием двух вторичных посредников: инозитол-1, 4, 5-трифосфата и диацилглицерола. В результате быстро повышается уровень инозитол-1, 4, 5-трифосфата и диацилглицерола в цитозоле. Оба продукта являются вторичными посредниками. Диацилглицерол остается на мембране и активирует протеинкиназу С, которая мигрирует к мембране из цитозоля. Растворимый в воде инозитол-1, 4, 5-трифосфат свободно проходит через цитозоль и стимулирует освобождение ионов Са²⁺ из саркоплазматического ретикулума. Таким образом, как инозитол-1, 4, 5-трифосфат, так и диацилглицерол являются продуктами метаболизма мембранных фосфолипидов [13, 291].

Кроме фосфатидилинозитола, в клетке имеется другой, наиболее часто встречающийся фосфолипид, который также может являться источником диацилглицерола. Этим фосфолипидом является фосфатидилхолин. Клетка способна продуцировать диацилглицерол из фосфатидилхолина двумя путями: во-первых, фосфолипаза С способна прямо конвертировать фосфатидилхолин в фосфохолин и диацилглицерол; и во-вторых, фосфолипаза D может конвертировать фосфатидилхолин в холин и фосфо-диацилглицерол. В последующем фосфо-диацилглицерол конвертируется в диацилглицерол при помощи специфической фосфогидролазы.

Рецепторы к инозитол-1, 4, 5-трифосфату представляют из себя лиганд-зависимые Са²⁺ -каналы, локализованные на мембране саркоплазматического ретикулума, по структуре они относятся к Са²⁺-освобождающим каналам и отвечают за освобождение ионов Са²⁺ из саркоплазматического ретикулума.

Рис.13. С хема основных механизмов сокращения в гладкомышечной клетке (объяснение в тексте).

СПР - саркоплазматический ретикулум, ИФ₃ – инозитол-1, 4, 5-трифосфат, ДГ – диацилглицерол, КЛЦМ – киназа легких цепей миозина, ФЛЦМ – фосфатаза легких цепей миозина.

Взаимодействие инозитол-1, 4, 5-трифосфата с рецептором приводит к пассивному выходу Ca²⁺ из саркоплазматического ретикулума и, соответственно, к быстрому повышению концентрации свободного Ca²⁺ в цитозоле. Повышение концентрации Ca²⁺ может быть кратковременным или продолжительным, может регулярно колебаться, увеличиваясь волнообразно, а также может распространяться на группу клеток, связанных между собой нексусами [21].

Диацилглицерол, совместно с ионами Ca²⁺, активирует протеинкиназу С, которая фосфоирлирует специфические клеточные белки. В гладкой мышце существует несколько изозимов протеинкиназы С, и у каждой из них специфическая роль. В большинстве случаев протенкиназа С участвует в реализации и регуляции механизма сокращения – фосфорилирует L-тип Са²⁺каналов или другие белки, регулирующие образование поперечных мостиков.

Кроме возможности инициировать вход Са²⁺ с помощью лиганд-управляемых каналов (т.е. с помощью каналов, активируемых связанными с G-белком рецепторами), в гладкой мышце существует возможность активировать еще один класс каналов – депо-управляемые Са²⁺ каналы, который играет чрезвычайно важную роль. Активация этого класса Са²⁺ каналов происходит следующим образом: нейротрансмиттер или агонист активирует рецептор и, в последующем, фосфолипазу С через G-белок или тирозин-киназу. Фосфолипаза С гидролизует фосфатидилинозитолби фосфат и образуется инозитолтрифосфат, активируются соответствующие Са-каналы саркоплазматического ретикулума, ионы Са²⁺освобождаются из саркоплазматического ретикулума и запасы Са²⁺ истощаются. В результате активируются депо-управляемые Са²⁺ каналы плазматической мембраны. Внеклеточный Са²⁺ входит через депо-управляемые Са²⁺ каналы, повышается внутриклеточная концентрация Са²⁺ и, следовательно, запасы Са²⁺ в саркоплазматическом ретикулуме восстанавливаются (рис.14) [136, 185].

Сокращение гладкомышечной клетки может не зависеть от внутриклеточной концентрации ионов Са²⁺. В данном случае сокращение возможно благодаря повышенной чувствительности сократительного аппарата клетки к ионам Са²⁺, которое подразумевает участие внутриклеточного сигнального пути Rho-киназы [303].

Рис.14. Физиологические пути активации депо-управляемых Са-каналов. ТК-тирозин-киназа, ФИФ₂–фосфатидилинозитолбифосфат, ИФ₃-инозитолтрифосфат, СПР – саркоплазматический ретикулум, SOCканал – депо-активируемые каналы.

Каким же образом активируется вход ионов Са²⁺, зависимый от истощения его запасов в клетке? R.S.Lewis (2007) предложил модель активации входа Са, рассматривая плазматическую мембрану и саркоплазматический ретикулум, как единую функциональную единицу, меняющую свое расположение в клетке в зависимости от концентрации ионов Са²⁺ в саркоплазматическом ретикулуме, образно назвав это изменение «молекулярной хореографией депо-управляемых кальциевых каналов». Прототипом депо-управляемых кальциевых каналов явились так называемые активированные освобождением кальция кальциевые каналы – CRAC каналы (Ca²⁺-release-activated Са²⁺ channel). Активным компонентом CRAC канала теплокровных служит Orai1 - белок плазматической мембраны, состоящий из четырех мембранно-связанных участков с N и C внутриклеточными концами. В саркоплазматическом ретикулуме имеется специфический белок STIM1, который является сенсором депо-управляемого кальциевого входа.

В покоящейся клетке с саркоплазматическим ретикулумом, заполненным ионами Са²⁺, STIM1 и Orai1 распределены довольно равномерно по мембране саркоплазматического ретикулума и плазматической мембране, соответсвенно. Истощение запасов Са²⁺ приводит к смещению CRAC каналов с Orai1 компонентами и выстраиванию в непосредственной близости от них кластеров STIM1белков. И исключительно в такой ко-локализации возможна активация CRAC канала и вход ионов Са²⁺ в клетку (рис.15) [185]. Интересно отметить, что в гладкой мышце некоторые стимулы могут вызвать сокращение, не зависимое от значительного увеличения концентрации внутриклеточного кальция. Одним из механизмов является непосредственная модуляция активности сократительных или регуляторных белков. Данный вывод сделан на основании того, что сила сокращения, развиваемая при определенной концентрации внутриклеточного Са²⁺ может быть различной. Соотношение сила/внутриклеточная концентрация Са²⁺ может быть повышенным или пониженным. Как правило это соотношение выше при фармакомеханическом сопряжении, чем при электромеханическом сопряжении. В основе развития сокращения гладкой мышцы лежит фосфорилирование легкой цепи миозина. Поэтому Са²⁺-независимое сокращение может быть результатом как повышения скорости фосфорилирования легких цепей миозина соответствующей киназой, так и понижением скорости дефосфорилирования легких цепей миозина соответствующей фосфатазой. Активность фосфатазы легких цепей миозина может понижаться вторичным внутриклеточным посредником - протеинкиназой С. Следовательно, некоторые возбуждающие импульсы способны инициировать сокращение гладкой мышцы, одновременно вызывая освобождение Са²⁺ из саркоплазматического ретикулума (с помощью инозитол-1, 4, 5-трифосфата) и уменьшая активность фосфатазы легких цепей миозина (с помощью протеинкиназы С).

Рис.15. Механизм действия функциональной единицы, состоящей из мембраны, саркоплазматического ретикулума и специфических белков, активация которой приводит к депо-управляемому входу ионов Са.

4.3.3. Са²⁺ спарки

В процессе инициации сокращения мышечной клетки всех типов основную роль играет увеличение внутриклеточной концентрации ионов кальция. Для гладкомышечной клетки весьма характерны регулярные, кратковременные, локальные выбросы ионов Са²⁺ из саркоплазматического ретикулума в саркоплазму, которые наблюдаются в непосредственной близости к плазматической мембране – так называемые Са²⁺ спарки («spark» - вспышка) [34, 146, 201, 375]. Са²⁺ спарки присущи различным типам гладкомышечных клеток. После активации потенциал-зависимых Са²⁺ каналов плазматической мембраны и прохождения ионов Са²⁺ в клетку, активируются кластеры каналов рианодиновых рецепторов, которые представляют из себя ионные каналы саркоплазматического ретикулума, активируемые рианодином. Ионы кальция выходят из саркоплазматического ретикулума в саркоплазму и приводят к появлению спарков (рис.16).

Рис. 16. Возникновение Са²⁺ спарка (объяснение в тексте).

В гладкой мышце большинство Са²⁺ спарков наблюдаются в непосредственной близости от плазматической мембраны. Причем, при некоторых условиях концентрация ионов Са²⁺ вблизи саркоплазмы может быть значительно выше, чем концентрация глобального цитозольного Са²⁺. Простой Са²⁺ спарк способен вызвать высокое локальное повышение концентрации ионов Са²⁺ до 10-100μ М, при этом общий (глобальный) уровень концентрации ионов Са²⁺ повышается не более чем на 2nM. Са²⁺ спарки, обладая способностью значительно и локально повышать концентрацию ионов Са²⁺, способны модулировать активность внутриклеточных ферментов и другие Са²⁺-регулируемые процессы в клетке, не зависимо от глобального повышения внутриклеточной концентрации ионов Са²⁺.

В гладкой мышце имеются три важнейших компонента: потенциал-зависимые Са²⁺ каналы, каналы рианодиновых рецепторов и Са-активируемые К каналы, которые составляют своеобразную функциональную единицу, обеспечивающую регуляцию уровня внутриклеточного Са²⁺ и процесс сокращения. Общая схема взаимоотношений между ними представлена на рис. 17. В большинстве типов гладкомышечных клеток при возбуждении в первую очередь открываются потенциал-зависимые Са²⁺ каналы. Вход ионов Са²⁺ активирует рианодиновые рецепторы, в результате возникает Са²⁺-спарк. Скорость и эффективность способности потенциал-зависимых Са²⁺ каналов активировать Са²⁺ спарк зависит от их близости друг к другу. Вклад Са²⁺-спарка в общую (глобальную) внутриклеточную концентрацию может быть значительным в фазных гладких мышцах и менее важным в тонических гладких мышцах. Са²⁺ спарки могут оказывать влияние на работу потенциал-зависимых Са²⁺ каналов как по механизму отрицательной, так и положительной обратной связи [270, 363].

Рис.17. Схема взаимоотношений между потенциал-зависимыми Са²⁺ каналами, Са²⁺-каналами рианодиновых рецепторов и Са-активируемыми К⁺ каналами в гладкомышечной клетке. РиР – канал рианодинового рецептора.

Взаимодействие Са²⁺ спарка и Са-активируемого К⁺ канала является местным. По механизму отрицательной обратной связи Са²⁺ спарк активирует Са-активируемые К⁺ каналы, что приводит к значительной гиперполяризации мембраны. В результате гиперполяризации потенциал-зависимые Са²⁺ каналы закрываются. Результатом является уменьшение уровня внутриклеточного Са²⁺ и расслабление. Эта отрицательная обратная связь может быть чрезвычайно важной для тонических гладких мышц, например, для мышц сосудов. Описываемый механизм лежит в основе действия оксида азота, мощного вазодилятатора, а также других применяемых в клинической практике нитровазодилятаторов, которые, активируя гуанилатциклазу, приводят к увеличению образования цГМФ и последующей активации цГМФ-зависимой протеинкиназыG

С другой стороны, по механизму положительной обратной связи Са²⁺ спарки активируют Са-активируемые Cl^- каналы, что приводит к деполяризации мембраны и, соответственно, к дополнительной активации потенциал-зависимых Са²⁺ каналов, к увеличению внутриклеточной концентрации Са²⁺ и к сокращению.

В настоящее время считается, что в процессе реализации физиологических эффектов Са²⁺ спарков принимают участие внутриклеточные протеинкиназы. Активация протеинкиназы A или протеинкиназы G повышает частоту Са²⁺ спарков и повышает выход Са²⁺ из саркоплазматического ретикулума (возможно через активацию АТФ-азы). Повышенная частота Са²⁺ спарков может быть следствием прямого эффекта на каналы рианодиновых рецепторов и/или является вторичным эффектом повышенного выхода Са²⁺ из саркоплазматического ретикулума. Кроме этого, активация протеинкиназы A или протеинкиназы G также повышает активность Са-активируемых К⁺ каналов. Повышенная частота Са²⁺ спарков и прямая активация Са-активируемых К каналов, синергично приводят к значительному повышению активности Са-активируемых К⁺ каналов. Последующая гиперполяризация мембранного потенциала закрывает L-тип Са²⁺ каналов, в результате уменьшается вход Са²⁺, следовательно, уменьшается концентрация цитозольного Са²⁺, что в итоге приводит к вазодилятации [16, 17, 33, 51, 161, 171, 215, 253, 269, 326, 341, 360].

В отличие от этого, активация протеинкиназы C понижает частоту Са²⁺ спарков благодаря прямому ингибиторному эффекту на каналы рианодиновых рецепторов и Са-активируемые К⁺ каналы, соответственно. В результате возникает деполяризация мембраны и активация L-типа Са²⁺ каналов (рис.18).

Рис. 18. Са²⁺ спарки. Возможные механизмы действия протеинкиназы А (PKA), протеинкиназы С (PKC) и протеинкиназы G (PKG) на Са²⁺ спарки, Са-активируемые-К⁺ каналы и Са²⁺ АТФ-азу саркоплазматического ретикулума в гладкомышечных клетках артерий. Pl – фосфоламбан.

Модуляция частоты и амплитуды Са²⁺ спарков в гладкой мышце приводит к регуляции уровня мембранного потенциала и контролю сократимости гладкой мышцы. Протеинкиназа А, протеинкиназа G и протеинкиназа С имеют исключительно важное значение в модуляции частоты и амплитуды Са²⁺ спарков. Эти киназы приводят в действие координированную и согласованную работу ключевых элементов Са²⁺ сигнализации, включая потенциал-зависимые Са²⁺ каналы, каналы рианодиновых рецепторов, фосфоламбан, и Са-активируемые К⁺ каналы. Конкретные молекулярные мишени, которые определяют частоту и амплитуду модуляции Са²⁺ спарков различными киназами пока еще не понятны. Однако, несомненно, модуляция Са²⁺ спарков имеет важное значение в регуляции функций гладких мышц [281].