Цитотоксическая активность эфирных масел растений и антибактериальные свойства

Наличие питательных и регенерирующих ингредиентов в составах косметических и бальнеологических препаратов вынуждает разработчиков использовать компоненты, блокирующие развитие и накопление микрофлоры в процессе производства и хранения продукции. И большинство фирм, представленных на российском рынке, не думают о потребителях, используя разнообразные ингредиенты из «обоймы» её величества «Большой химии». А собственно, что тут думать - «Наливай и пей!», как говорят в народе. Вот так и засоряется наш рынок косметическими препаратами первого поколения.

В подавляющем большинстве составов таких средств содержатся добавки, блокирующие развитие микрофлоры, с которыми человечество до этого никогда не встречалось. Детальный анализ присутствия таких веществ в косметических средствах и их названия приведены в монографии автора «Теория мягких косметологических воздействий. Современная косметология». Содержание книги опубликовано в виде уроков «Заочной школы научной косметологии» (на сайте: www.scicosmetsoc.ru). Конечно, по большому счёту, бедному человечеству использование большой или малой химии, наносимой на поверхности наших бренных тел, «выходит боком». Правда в последние годы потребитель поумнел, и мучает распространителей, продавцов и разработчиков каверзными вопросами о возможной токсичности. А так называемые «специалисты» вертятся как «ужи на сковородке», пытаясь доказывать их безопасность, и придумывая невероятные или прямо таки сказочные истории.

В качестве примера можно привести такой консервант, как Kathon CG. У него имеется ещё более 20 промышленных обозначений (Acticide, Amerstat 250, Grotan K, Parmetol ит.д.). Как вы думаете, уважаемые читатели, для чего нужна такая специфическая игра «в прятки»? Те из вас, которые имеют собственное мнение по этому вопросу, напишите. По сути это смесь двух веществ в соотношении!: 3 (для любопытных привожу их формулы - 2-Метил-4-изотиазолин-3-ОН и 5-хлор-2-метил-3(2Н)-изотиазолин-3-ОН). Одно из них входящее в смесь в трёхкратном количестве является хлорированным аналогом первого вещества, и фактически может отвечать за токсичность этой смеси. А вот «специалисты» уверяют нас, что эти вещества: 1) являются токсичными для бактерий только в герметичной упаковке, а при её вскрытии разрушаются (видимо, окисляясь); 2) они быстро испаряются при нанесении на кожу; 3) эти вещества вообще не токсичны, и приводят некие данные американских исследователей о якобы низкой токсичности первого (не хлорированного) вещества. Правда, не объясняют, как они сдерживают рост бактерий. Я не стану утомлять вас детальным разбором приводимых доводов. Как химик по образованию я утверждаю, что это, ласково говоря, сказки, называемые в народе «навешивание лапши на уши», а на мой взгляд, это явная ложь! Главное для производителя и продавцов прибыль, а не образованные потребители всё равно купят не с одним названием, так с другим. Закончили с этим трудным материалом и вернёмся к растительному сырью.

На первый взгляд может показаться, что наиболее приемлемыми для блокировки развития бактерий можно найти среди препаратов растительного происхождения. Косметические средства, содержащие такие препараты, на рынке имеются. В литературе активно обсуждается роль эфирных масел растений вСущественную роль при этом должны играть представления не только о лечебном, антибактериальном и противовирусном действии выбираемых добавок, но и их концентрации, способные проявлять цитотоксические свойства. Поэтому необходимо иметь представления о предельно допустимых концентрациях растительных добавок безопасных для человека. Например, эфирных масел растений. Многие из них обладают антибактериальной активностью, да и могут композициям придавать приятный запах. Я не буду останавливаться на составах эфирных масел и их производстве. Для освещения этих вопросов можно заглянуть в фундаментальный труд С.А. Войткевича «Эфирные масла для парфюмерии и ароматерапии» М., Пишевая промышленность, 1999, с.282. Приводим результаты нашего определения предельно допустимых концентраций эфирных масел (цитотоксической активности). Это нам с вами пригодится. В работе представлены результаты такого рода исследований для эфирных масел растений.

Предельно допустимые концентрации эфирных масел в косметических средствах (статья)

Одной из основных проблем современной косметологии является оценка безопасности косметических препаратов с использованием клеточных тест-систем. Данное утверждение базируется не на широко распространенной точке зрения о недопустимости использования животных в лабораторных экспериментах по определению безопасности косметических препаратов. Дело в том, что низкомолекулярные компоненты косметических средств в процессе преодоления кожного барьера вначале взаимодействуют с клеточной системой и мжклеточной жидкостью в эпидермисе. Затем, очевидно, распределяясь в лимфатической и кровеносной системах, они воздействуют на внутренние органы и организм человека в целом. Поэтому наличие в составах препаратов токсичных ингредиентов будет определять не только неблагоприятное воздействие на клеточные системы эпидермиса, но и на клеточные системы организма.

Очень близкая ситуация реализуется в ходе профилактики и лечения легочных патологий с использованием аэрозольного метода в частности, аромотерапевтического воздействия на легочную ткань и слизистые оболочки (туберкулез, рак легких, бронхиты, астматические состояния и т.д.). Аналогичные рассуждения применимы при создании препаратов для профилактики и лечения заболеваний полости рта (гингивиты, стоматиты и т.д.). Во всех перечисленных и других аналогичных ситуациях, сведения о результатах прямого контакта используемых в препаратах ингредиентов с клеточными системами организма человека или на клеточных культурах животных позволяют более адекватно описывать механизм их взаимодействия. И тем самым принимать обоснованные рекомендации по применению и производить осознанный отбор биологически активных веществ и эффективных средств.

Применительно к косметологии, в соответствии с «теорией мягких косметологических воздействий», любые действия, направленные на ухудшение комфортности существования базальных клеток эпидермиса, приводят к снижению скорости их деления, что в итоге приводит к ускорению процессов старения кожи. Поэтому, в соответствии с данной теорией, наиболее адекватные результаты влияния компонентов косметических средств на кожу могут быть получены только на клеточных тест-системах, моделирующих функционирование клеточных систем. Следует особо подчеркнуть, что речь здесь идет не только об опасности ингредиентов косметических средств для организма человека в целом, но и о возможных неблагоприятных воздействиях именно на клетки эпидермиса.

Ингредиентами, которые могут способствовать ускорению процесса старения кожи, в первую очередь, являются биоцидные добавки (консерванты), вводимые в составы косметических препаратов для предотвращения развития микроорганизмов. Можно было полагать, что величины предельно допустимых концентраций (ПДК) таких добавок, определенные на клеточных тест-системах, окажутся значительно более низкими по сравнению с влиянием аналогичных веществ на организм, определяемым с использованием животных и добровольцев.

Экспериментально (из сопоставления рекомендованных в косметических средствах концентраций с результатами тестирования на клетках) это было прослежено в работах автора, в основном, для химически синтезированных консервантов (имидазолидинил мочевина, диазолидинил мочевина, иодопропенилбутилкарбамат и парабены в разных сочетаниях). Накопленные к настоящему времени данные однозначно свидетельствуют об опасности для организма человека такого рода химически синтезированных добавок. Поэтому некоторые разработчики и производители косметических средств начинают искать выход из создавшегося «биоцидного концентрационного тупика», пытаясь использовать в качестве биоцидных консервирующих систем эфирные масла и экстракты растений.

В данной работе указывается на то, что среднее значение ПДК эфирных масел растений составляет примерно 0.01%. Это свидетельствует о достаточно высокой цитотоксической активности рассмотренных препаратов. Оценка проводилась на перевиваемой культуре клеток легких эмбриона человека в присутствии 5% этилового спирта. Приблизительность полученного значения и использование несколько необычной (не стандартной) клеточной тест-системы послужили поводом для более детального исследования цитотоксической активности эфирных масел растений.

Методика эксперимента

Как это описывалось ранее, для оценки цитотоксической активности (цитотоксичности) препаратов использовали стандартно применяемую для этих целей культуру клеток Vero (клетки почки зеленой мартышки), которую выращивали в лунках плоскодонных 96-луночных планшетов. В культуральную псреду добавляли серийные разведения исследуемых растворов эфирных масел растений. После инкубирования в течение 3-х суток, монослой клеток прокрашивали витальным красителем, вносили в лунку лизирующий раствор и количество красителя, включенного в монослой клеток, учитывали на спектрофотометре при длине волны 490 нм. В качестве контроля использовали лунки планшета, в которые исследуемые растворы эфирных масел не вносили (контроль качества процесса культивирования). Методика основана на том обстоятельстве, что при отсутствии токсичности клетки не погибают, и сохраняют способность фагоцитировать нейтральный красный.

Компьютерная обработка полученных данных в рамках уравнения y = (A-D) / (1+(x/C)^B)+D позволяла определять значения ТС50 и ТС10, соответствующие процентным концентрациям, добавляемых в лунки исходных спиртовых растворов эфирных масел растений, которые приводят к уничтожению клеточной популяции на 50% и 10%, соответственно. При этом вся совокупность полученных экспериментальных данных по стандартным разведениям для каждого препарата сопоставлялась с теоретической кривой, описываемой данным уравнением, с оценкой коэффициента аппроксимаций (R^2), характеризующего статистическую достоверность рассчитанных значений цитотоксичности (ТС50 и ТС10).

Значения ТС50 или ТС10, в зависимости от назначения могут рассматриваться в качестве ПДК. Применительно к задачам косметологии, если в соответствии с теорией мягких косметологических воздействий [1], придерживаться принципа «не навреди», из двух обсуждаемых значений цитотоксичности, на наш взгляд, более приемлемой для оценки ПДК (для повседневного ухода за кожей) является величина ТС10. Она характеризует концентрацию добавки, при которой процесс уничтожения клеточной системы только начинается (ТС10).

В качестве примера на прилагаемом рисунке представлены результаты изучения цитотоксичности спиртовых растворов эфирного масла чайного дерева (Melaleuca alternifolia) в исходных концентрациях 10.42 и 0.43% фирмы DDF (Australia).

Рис.4. Результаты изучения токсичности спиртовых растворов масла чайного дерева (с различной концентрацией).

В соответствии с ожидаемым, величина ТС₁₀ для раствора с более высокой исходной концентрацией, рассчитанная по уравнению с приведенными под графиком коэффициентами, равнялась 0.0239%. Это значительно меньше (и поэтому она более токсична) аналогичной величины, равной 0.4550%, для более разбавленного раствора. Однако, если провести нормировку этих значений с оценкой абсолютного содержания эфирного масла в этих растворах, то получаемые величины (соответственно, 0.0025 и 0.0020%) между собой существенно не отличаются. Именно среднее значение этих величин может характеризовать ПДК данного образца эфирного масла чайного дерева (ПДКкос) в косметических средствах, используемых для повседневного ухода за кожей. Иначе для расчёта ориентировочного эффекта цитотоксичности при переходе от одной концентрации эфирного масла к другой достаточно решить несложную обратную пропорцию. Например. для рассмотренного выше варианта ТС10=0.43*0.0239/10.42 = 0.001%. Действительно на графике влияние эфирного масла в более высокой концентрации на клеточную культуру ведёт к снижению количества живых клеток, которое начинается примерно с этой величины.

В работе исследовались образцы эфирных масел растений следующих фирм производителей и поставщиков: DDF (Australia) P/L, Сибирский завод экстрактов и биотехнологий, ООО «Флория», ЗАО “Евроресурс”.

Результаты и обсуждение

Результаты исследований и расчетов ПДКкос (ТС10) представлены в нижеприведенной таблице.

Таблица 7 (в книге). Результаты определения цитопатической активности эфирных масел растений - расчет ПДК для косметических средств

Обращает на себя внимание, что для всех исследованных образцов эфирных масел растений интервал изменений и абсолютные значения ПДКкос (ТС10) невелики (от 0, 0001 до 0, 0044%) что отражает высокую цитотоксическую активность препаратов. Несколько выпадает из этого ряда опытный образец эфирного масла листьев смородины, предоставленный сотрудниками кафедры товароведения непродовольственных товаров Красноярского торгово-экономического института (таблица, - требуется дополнительная проверка).

Рассмотрим полученные данные применительно к задачам, которые ставят разработчики, включая эфирные масла растений в составы косметических средств. К таким задачам, в первую очередь, следует отнести использование эфирных масел растений в качестве:

- ароматизаторов (отдушек);

- биоцидных консервирующих добавок;

- добавок, обладающих лечебным действием.

Последнее (очевидно, очень важное) направление их использования можно определить как кратковременное, определяемое длительностью лечебного процесса, и не имеющее прямого отношения к косметологии. В данном случае концентрация эфирного масла в препарате также будет определяться потребностью процесса лечения (например, лечения угревой сыпи).

В отличие от этого, два первых направления предусматривают обычное (повседневное) применение косметических средств, не ограниченное по времени. Поэтому вопрос о концентрации эфирных масел в косметических препаратах и результатах их взаимодействия с клеточными системами кожи приобретает особое значение.

Приведенные в таблице величины ПДКкос могут быть использованы для целенаправленного подбора безопасных концентраций эфирных масел при их использовании в качестве ароматизаторов (отдушек).Причем вопрос об оценке предельно допустимых концентраций ароматических веществ должен ставиться во главу угла, перед тем как человек начнет практиковать регулярные контакты с ароматизирующими субстанциями. Цитирую фрагмент рассуждений маркетологов [35] о том, что некоторые компании рассматривают возможность использования эфирных масел (без добавления химикатов) для ароматизации воздуха во время приготовления пищи: «Ваш дом наполнится ароматами сандалового дерева, гвоздики и экзотического зверобоя в сочетании с ароматом мускуса. Стоит только попробовать - и вместе со шлейфом волнующих ароматов к вам придут гармония, признание, успех». Чувствуется рука опытного сладкоречивого маркетолога (продавца). Не знаю как с «гармонией, признанием и успехом», но хорошо бы подумать, прежде чем подвергать себя и своих домочадцев регулярным процедурам бесконтрольной ароматерапии. О примитивной рекламе мы уже говорили. Вместо этой пустопорожней болтовни, рассчитанной на необразованных домохозяек, которые, может быть, вам и поверят - эмоции превыше всего! А нам необходимо получить надежную информацию о безопасности (ПДК, в сочетании с длительностью воздействия) используемых ароматизирующих систем. Но рекламист рассчитывает на эмоции и сам не знает, что он рекламирует. А вы, поддавшись на его красноречие, может быть, способствуете сокращению жизни домочадцев. В отличие от ваших бабушек, которые если и пользовались ароматами, но от растений, а не их концентратами. Такие рассуждения касаются и бытовых спреев. Я с ужасом слышу, как жена их использует в ванной комнате и в туалете - ведь большая химия вошла в нашу жизнь прочно и, по-видимому, надолго. Но привычка - вторая натура. Источники ароматов обычно не указываются на этикетках. Так компания «За безопасную косметику» опубликовала результаты исследований, которые проводилось в независимой лаборатории на 17 самых продаваемых косметических продуктах, в результате было обнаружено, что в среднем 14 химических веществ не перечислены на этикетках. Также обнаружили, что действие присутствующих в каждом продукте четырех (в среднем) химических веществ, разрушительно для гормонов, препятствуют эстрогенам щитовидной железы. Вот вам ещё случай бездумного использования токсических ароматов [36].

На наш взгляд, более понятным является тот факт, что попытки введения эфирных масел в косметические средства для блокировки развития микрофлоры (биоцидное консервирующее действие), снова (см. выше) с неизбежностью приводят разработчиков к “биоцидному концентрационному тупику”.

Рассмотрим это обстоятельство на примере эфирного масла чайного дерева, антибактериальные, фунгицидные и противовирусные свойства которого интенсивно изучаются в последние годы. Так, например, это масло зарегистрировано в Австралийском Национальном Совете по Медицинским Исследованиям, Американской и Европейской фармакопеях как противогрибковое и бактерицидное средство. Благодаря этим свойствам и способности быстро проникать в кожу, оно, как и многие другие эфирные масла, используется в составах препаратов многочисленных фирм – производителей косметических средств. А упоминаемая ранее тенденция замены химически синтезированных консервирующих биоцидных агентов в составах косметических препаратов с целью выхода из «биоцидного концентрационного тупика» на системы растительного происхождения делает эфирное масло чайного дерева привлекательным для этой цели.

Известно, что минимальная ингибирующая активность по отношению к различным видам микроорганизмов у масла чайного дерева проявляется при концентрациях от 0.1 до 0.75% (среднее значение по 11 видам микроорганизмов составляет ~0.36%). Из этого следует, что для достижения эффекта ингибирования размножения микроорганизмов в косметических средствах необходимо превысить экспериментально установленные для образцов эфирных масел чайного дерева величины ПДКкос:

- в 164 раза для образца фирмы DDF (Австралия) – табл. №42;

- в 514 раз для образца, поставленного фирмой ЗАО «Евроресурс» (производство – Германия) – табл. №24;

- в 1200 раз для образца № Е49-01 1022010, поставленного фирмой «Флория» (Россия) – табл. №7.

Ожидаемым результатом такого превышения может быть только ухудшение состояния клеток эпидермиса, вплоть до их полного уничтожения, которое может проявляться в виде отшелушивания верхнего слоя кожи (химический пилинг), но под действием эфирных масел растений. Процедуры такого рода, использующие особые свойства клеточных систем восстанавливать повреждения, относятся к реконструкционной косметологии [1]. Такие воздействия не соответствуют предъявляемому к косметическим средствам по уходу за кожей основному требованию, «сохранения кожи в хорошем состоянии» и не могут использоваться повседневно. Это несоответствие с позиций теории мягких косметологических воздействий составляет суть упоминаемого ранее «биоцидного концентрационного тупика», из которого следует, что эфирное масло чайного дерева не может быть использовано в косметических препаратах в качестве биоцидной консервирующей добавки.

Аналогичный вывод может быть сделан практически для всех приведенных в таблице препаратов и, по-видимому, для других подобных субстанций, так как в настоящее время отсутствуют сведения о существовании образцов эфирных масел растений, которые обладали бы широким спектром антибактериального действия в концентрациях более низких, чем установленные для них ПДКкос.

Учитывая также ранее полученное нами экспериментальное подтверждение существования «биоцидного концентрационного тупика» для химически синтезированных веществ [37], можно высказать предположение о том, что ни одна из существующих консервирующих систем, используемых в качестве биоцидных добавок к косметическим препаратам, не способна блокировать развитие микроорганизмов без ущерба для клеточных систем кожи. Поэтому с большой долей вероятности можно полагать, что исследования, направленные на поиск биоцидных консервирующих добавок, не обладающих токсичностью по отношению к клеточным системам, вообще являются тупиковым направлением в научной косметологии. Р азработчикам косметических средств более целесообразно было бы сосредоточиться на разработках, связанных с созданием технологических приемов и подходов, позволяющих исключать биоцидные консервирующие добавки из составов косметических средств. В работе [38] приведена классификация, из которой следует, что препараты, не содержащие консервирующих добавок, приближаются к IV (или точнее к III) поколению косметических средств. В этой же работе рассмотрена возможность существования препаратов такого рода, а движение в направлении их создания иллюстрируется предпринятым недавно Научным косметологическим обществом анализом составов производимых в мире косметических средств [38].

Авторы статьи: Децина А.Н.*, Беланов Е.Ф.**, Балахнин С.М.**, Петров А.П.*

*) Некоммерческое партнерство «Научное косметологическое общество»;

**) Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор».

Предлагаю. Несколько отдохнуть от цифр.

Здесь можно позволить себе рассказать о двух встречах с известными представителями российской культуры.

Дмитрий Санджиев – художник, встреча с которым произошла в Доме художника на выставке его картин. Потом была ещё одна встреча в небольшом уютном зале, украшенном его картинами. Мы пили вино, беседа кружилась вокруг картин, и Дмитрий затронул проблему запахов. На некоторых его работах в том или ином варианте присутствовала Степь. Особенно мне запомнилась картина, на которой была изображена юрта, перед открытым входом в которую лежал мальчуган, подперевший подбородок кулачками и смотревший вдаль. Перед ним простиралась прямая просёлочная дорога, уходящая за горизонт. И Дмитрий сказал мечтательно: «Вот бы сделать так, чтобы от картины веяло запахом степи».

Мой предыдущий опыт поиска упаковки для наших желеобразных композиций свидетельствовал о существовании такой возможности. Мы заказали у гончаров небольшие керамические кувшинчики с пробочками, покрытые снаружи и внутри глазурью. Не покрытое глазурью снизу оставалось только донышко. Так как нужно было сохранять стерильность препаратов при хранении, мы притирали пробочки к горлышку ёмкости. Заполнили с десяток красивых упаковок, и выставили для хранения на полку стеллажа, застеленную бумагой. Буквально через неделю под каждым кувшинчиком образовалась лужица жидкости, а внутри остались скукоженные комочки наших препаратов. Обратите внимание на то, что освобождённое от глазури горлышко ёмкости не соприкасалось с её жидким содержимым. Это свидетельствует о переходе жидкости по внутренним капиллярам стенок кувшинчиков на стеллаж за счёт участия паровой фазы над препаратом. Всё это было изложено Дмитрию, и предложен вариант, связанный с изготовлением керамических рамок для картин с небольшими углублениями для размещения эфирных масел растений. Например, для «степных» картин художника можно было использовать эфирное масло полыни или другие композиции. Затем возник вопрос о возможности патентования такого подхода, чтобы только картины Дмитрия обладали бы такими свойствами. После возвращения в Кольцово я проконсультировался у Юрия Николаевича (начальник патентного отдела ГНЦ ВБ «Вектор») и оказалось, что патенты на запахи не регистрируются, и идея такого проекта благополучно канула в лету. Правда, несколько лет назад Юрий Николаевич сообщил, что выдан первый патент на обшивку салона автомашин материалом, который имеет запах клубники. Все желающие могут теперь реализовать подобные подходы, а патентовать их совершенно не обязательно. Автор например, мечтает о телевизоре, который генерировал бы запахи, соответствующие окружающей обстановке (лес, море, степь, цветущий сад и т.д.). Всё это, конечно, без превышения ПДК.

Алла Демидова – уважаемая мной актриса, встреча с которой произошла на всё той же выставке Д. Санджиева. Нас познакомила Наташа - сотрудница нашей фирмы, поддерживающая с ней связь и обеспечивающая Аллу косметикой. В интервью, опубликованном в журнале «Бьюти Про», на вопрос о том, как она поддерживает красоту лица, Алла сказала, что она «пользуется препаратами небольшой сибирской фирмы, включающей в свои составы различных морских гадов». Наташа договорилась с ней о встрече у неё дома. Говорили о косметике и упомянули об идее Дмитрия о запахах для картин. Алла рассказала нам две истории, связанные с использованием запахов в театральной жизни. В те времена, когда ещё был жив Владимир Высоцкий, и они ставили «Вишнёвый сад», Владимир возвращался из Парижа с большой ёмкостью вишнёвой отдушки. Перед спектаклями до появления зрителей этой жидкостью обрызгивали театральный занавес для создания дополнительного воздействия. Второй рассказ актрисы был связан с гастролями в Японии, где она с партнёром играла пьесу о любви с элементами, близкими к эротическим. Так вот, их помощник (импресарио) скупал ароматические палочки с эротическим действием по мнению японцев, и окуривал ими зрительный зал до прихода зрителей для создания соответствующего эффекта. Вот, пожалуй, и всё о запахах. Повторяю ещё раз о том, что необходимо ни в коем случае не превышать ПДК эфирных масел. Однако каким образом можно рассчитать, и нормировать их концентрацию для описываемых выше случаев использования?

Я и сам, стараясь освободиться от насморка неизвестной природы, засыпал с бумажной салфеткой, закреплённой на спальной одежде под подбородком, вдыхая аромат бергамотного масла. Здесь регулировка концентрации вдыхаемого запаха возможна по количеству наносимого на салфетку эфирного масла. Но всё-таки это недостаточно точно.

Если интересно, пишите как вы используете эфирные масла.

Следующее исследование будет посвещено экстрактам растений.

Искренне ваш.

Анатолий Децина